重组胱抑素c的表达及免疫活性分析

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1、硕士学位论文重组胱抑素C的表达及免疫活性分析学科专业临床检验诊断学学位类型
科学学位□专业学位研究生姓名蒋琰导师姓名、职称吴意教授论文编号湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一五年五月分类号密级学校代码10542学号201202201513重组胱抑素C的表达及免疫活性分析ExpressionandimmunocompetenceanalysisofrecombinantcystatinC论文编号研究生姓名蒋琰指导教师姓名、职称吴意教授学科专业临床检验诊断学研究方向临床检验诊断湖南师范大学学位评定委员会办公

2、室二零一五年五月湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，致立进行研究工作所取得的成果。除文中氏经注明引用的巧容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中Ｗ明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。＇学位论文作者签名２４日：年厂月湖南师范大学学位论文版权使用授权书、使用学位论文的规定本学位论文作者完全了解学校有关保留，研究生在校攻读学位期间论文王作的知

3、巧产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可Ｌ义将本学位论文的全、缩印或扫描部或部分内容编入有关数据库进行检索，可Ｌ乂采用影巧等复制手段保存和汇编本学位论文。幕瓜乐曰作者签名：＾曰期每喊导师签養：曰期：年月乃＾裹心巧＾重组胱抑素C的表达及免疫原性分析摘要目的：1.表达和纯化重组的人胱抑素C(cystatinC,CysC)蛋白；2.鉴定纯化的重组CysC蛋白；3.重组CysC蛋白的免疫活性的检

4、测。方法：1.根据GenBank中人CysC功能区的氨基酸序列，选择大肠埃希菌喜好的编码密码子设计合成编码基因序列，利用PCR（聚合酶链式反应）获取目的片段，在原核系统中表达重组人胱抑素C蛋白。2.纯化表达的CysC重组蛋白，用间接酶联免疫吸附测定法（间接ELISA法）测定其反应灵敏度及免疫活性。结果：1.PCR扩增CysC后经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在250~500bp位置处发现唯一一条清晰的、大小约为450bp的DNA条带，相对分子质量大小与CysC基因大小相符，因此可初步确定为目的条带。构建的重组

5、载体pMD18-T-CysC，经BamHI和XhoI双酶切鉴定后可见两条条带，与预期结果一致，经过上海生工公司测序，证明为CysC编码序列；2.将连接表达载体的连接物诱导表达，SDS-PAGE后发现诱导后的菌株表达了一个大小约为35kD的蛋白，而在对照组中没有出现这一I硕士学位论文条带，初步说明重组基因在大肠杆菌中获得了有效表达；3.WesternBlotting结果显示，表达的重组蛋白与抗CysC多克隆抗体在大小约为35kD处发生了反应，而阴性对照则没有此条带的出现，进一步说明了重组蛋白为CysC蛋白，并

6、且具有良好的免疫反应活性；4.间接ELISA结果显示，在包被浓度为0.5mg/L时便产生了阳性值（一般以阴性值的2.1倍设为临界值），表明该重组蛋白具有极高的反应灵敏度。结论：1.成功建立了CysC原核表达系统；2.CysC重组蛋白具有良好的反应灵敏度；3.CysC重组蛋白免疫小鼠后血清中IgG效价已达制备单克隆抗体的要求，为CysC单克隆抗体的制备打下夯实的基础。关键词：CysC；原核表达；反应灵敏度；免疫活性分析II重组胱抑素C的表达及免疫原性分析ABSTRACTObjective：1.Toexpres

7、sandpurifytherecombinantCysC.2.ToidentifytherecombinationCysC.3.TodetectedtheimmunocompetenceofrecombinantCysC.Method:1.AccordingtohumanCysCfunctionalareassequenceofinGenBank,TheCysCtargetgenesobtainedbyPCRamplificationwhichisselectedEscherichiacolicodonen

8、codetherelevantgenesequencewithtemplate.HumanCystatinCareexpressedinE.coli.2.TherecombinantCysCwaspurified,thenweusetheindirectenzymelinkedimmunosorbentassay(indirectELISA)todetectitssensitivityandimmunogenic