菊花rnai载体构建与青蒿遗传再生体系的建立

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1、＇单位代码１０４７５＇？学号１０４７５３１２０９７０分类号７Ｑ３呼為乂聲硕：ｔ学位论文＇菊花ＲＮＡｉ载休构建与青富遗传再生体系的建立学科、专业：遗传学研究方向：植物表观遗传学申请学位类别：理学硕±申请人：马焕新指导教师？；王子成教授二〇—五年五月CONSTRUCTIONOFRNAiEXPRESSIONVECTOROFDENDRANTHEMA×MORIFOLIUMMET1GENEANDESTABLISHMENTOFREGENERATIONSYSTEMOFARTEMISIAANN

2、UAL.ADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByMaHuanxinSupervisor:Prof.WangZichengMay,2015摘要菊花（Dendranthema×morifolium）是多年生宿根草本植物，因其品种、花色和花型众多，具有很高的观赏价值，而备受大众喜爱和研究者的青睐。青蒿（ArtemisiaannuaL.）是一年生草本植物，常作为菊

3、花嫁接的优良砧木。DNA甲基化是表观遗传学的一种重要的修饰方式，在植物中普遍存在且发挥着重要的作用。RNAi(RNAiinterference)是关闭特定基因的新技术，在植物功能基因组、植物育种、植物抗逆方面得到广泛应用。本研究以DNA甲基化修饰能影响植物的形态特征以及RNAi信号能够通过砧木传递作为研究基础。构建能够影响菊花但不影响青蒿MET1基因的RNAi载体，同时建立青蒿的遗传再生体系，为后续的遗传转化奠定了基础。研究主要结果如下：（1）靶基因序列克隆以菊花紫精灵为实验材料，克隆得到含有不同酶切位点、大小为273bp的片段，经测序分析，同源性为97%。确定该

4、序列即为紫精灵MET1基因的一部分。（2）菊花RNAi载体的构建将靶基因片段通过酶切-连接法，正反向插入载体DHpart27RNAiFADP1P4上，经特异性引物PCR扩增验证、酶切和测序，证实菊花MET1基因序列在载体构建中未发生突变，RNAi载体构建成功。通过冻融法成功将RNAi载体转入农杆菌GV3101中。（3）本研究取自种青蒿生长40天的幼嫩的叶片、叶柄为外植体，建立了叶片和叶柄的遗传再生体系。①叶片和叶柄最佳的消毒效果分别是：0.1%的升汞中浸泡8mim和0.1%的升汞中浸泡10mim。叶片和叶柄存活率分别达到92.1%和84.5%。②最佳愈伤诱导培养基

5、实验结果表明，叶片和叶柄均在培养基配方为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上愈伤诱导最好，并且叶柄诱导率达到95.7%,远高于叶片的诱导率（78%）。③最佳分化培养基叶片在培养基MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LNAA+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上分化率最高达到95.3%。叶柄在培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+3%蔗I糖+0.7%琼脂粉的固体培养基上能一次成苗，成苗率为11%。④最优生根培养基将分化出的青蒿幼苗在1/2MS+1.0mg/LNAA+3%蔗糖

6、+0.7%琼脂粉的培养基上生根，在转接后的第6天，有白色的根眼萌发，根生长快并且粗壮，生根率达到98.9%。21天后将生好根的青蒿，移栽到室外，成活率为90%。关键词：菊花，RNAi载体，青蒿，遗传再生体系IIABSTACTChrysanthemum(Dendranthema×morifolium)isaperennialherbaceousplantwithperennialroot,whichispopularforitsexceptionallydiverseinvarieties,flowershapeandcolor.SweetWormwoodHerb(

7、ArtemisiaannuaL.)isannualherbsandregardedastherootstockusedinthechrysanthemumgrafting.Asthemostcommonepigeneticmodification,DNAmethylationplaysanimportantroleinplant.Asanewtechnologyforknockingoutspecificgenes,RNAi(RNAiinterference)isappliedextensivelytoplantfunctionalgenomics,plantst

8、ressr