湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能和肠道发育的影响

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河南农业大学学术硕士学位论文题目湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能和肠道发育的影响学位申请人姓名何如芳导师姓名李振田学科专业动物营养与饲料科学研究方向单胃动物营养中国郑州年月 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目：湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能和肠道发育的影响英文题目：Effectsofwetfermentedcompletefeedonperformanceandintestinaldevelopmentinweanedpiglets学位申请人：何如芳导师：李振田副教授专业：动物营养与饲料科学研究方向：单胃动物营养论文提交学位授予日期：日期： 河甫农业：学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归Ｍ承诺书尸￣￣学位论湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能巧肠道Ｉ二学位文题日发育的影响硕±英力Ｕ学生学科导师何如芳动物营养与饲料科学李振田姓名专业姓名学位论文如需保密，解密时间是巧化密ｊ独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进ｂ的研究工作及取得研巧成果，除了文中特别加Ｗ标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的硏巧成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材一。料，指导教师对此进行了审定与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献，并表示了谢意均己在论义中做了明确的说明。特此声明。研究生签名：：仙郁朱导师签名麥卡粟＾＜＾：７日期：么年／月／）曰円期吿月＾＞曰学位论文使用授权及知识产权巧属承诺本人完电Ｔ解河南巧业大巧关于保巧、使用学位论义的规定，即学生必巧－按照学校嬰求描文学位论文的印刷本和电子版本；学校有权化巧提交论义的印，■刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务可ｙ采用影印、缩印或描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可用不同方式在不同媒体上发表。、传播学位论文的全部或部分内容保办法》的有关规定，在业离本人完全了解《河南农业大学知识产权护毕一工论文，第署名单开河南农化，的科研作发表的所有人学后就在校期间从事南农位为河南农化乂学，试验材料、原始数据、利等知识产权均归河申报的专＝，巧扭业大学所巧巧则巧巧的法律责巧，＿。：保密学位论文在解密后适用于本授书注权研巧生签名：侣如导师签名；学院领导考４＾行比期么煎庄日期月田日月日０ｆＩＭ节郎冬 致谢本文从论文选题、试验方案设计、试验的有序开展以及到论文撰写等每个环节都是在李老师的悉心指导下逐步完成的。在整个试验和论文写作过程中，李老师以他渊博的知识、敏锐的洞察力、严谨的治学态度、精益求精的工作作风和他对科学无私的奉献精神给我留下了深刻的印象，这些言传身教和耳濡目染使我受益匪浅，并将成为我终身献身科学和事业的动力。在这三年的硕士研究生学习生涯里，动物营养和饲料科学导师组的康相涛教授、王成章教授、高腾云教授、王志祥教授、尹清强教授、严学兵教授、陈文教授、史莹华副教授、田亚东副教授和常娟副教授等在我学习和生活方面都给予了极大的帮助和指导，并对论文的开题和试验的实施提出了宝贵意见。感谢病理实验室梁红德教授和焦喜兰老师对我试验的指导和帮助。感谢动物营养和饲料科学教研室和草业科学教研室的齐胜利老师、姜义宝副教授、田玮老师和李德锋老师等一直以来对我的关心、支持和帮助。在整个试验过程中，得到了河南禹州发群种猪场场长李腾和诸多工作人员的热心帮助；也得到了刘婷、穆会杰、苏传友、王洁、梁新平、张宪磊、李海洋、姜山、朱群、王二柱、闫冰雪、孔阳光、冯永杰、张琼方、罗宽、付文红、赵晓楠、余莹、祁东风等师弟师妹，以及本校同学的鼎力相助。正是以上各位老师及同学的大力支持和帮助才使得我的试验得以顺利实施和圆满结束，在此表示由衷的感谢！同时，还要特别感谢研究生处以及牧医工程学院的各位领导和老师多年来在学习和生活上给予我的关怀和帮助！最后，再次向所有关心、帮助和支持我的老师、同学、朋友和亲人表示衷心的感谢！ 目录摘要...................................................................................................................................................11文献综述.......................................................................................................................................31.1断奶应激对仔猪肠道发育的影响............................................................................................31.1.1仔猪的断奶应激.................................................................................................................31.1.2仔猪肠道发育...................................................................................................................31.1.3断奶应激对仔猪肠道健康的影响.....................................................................................51.2抗生素........................................................................................................................................61.2.1抗生素促进动物生长的机理.............................................................................................61.2.2使用抗生素所带来的负面效应.........................................................................................61.2.3抗生素在应用时需注意的问题.........................................................................................61.3微生态制剂................................................................................................................................71.3.1微生态制剂的组成及作用机理.........................................................................................71.3.2微生态制剂在断奶仔猪生产中的应用.............................................................................71.3.3微生态制剂在运用时需注意的问题.................................................................................81.4发酵饲料....................................................................................................................................81.4.1发酵饲料的特性.................................................................................................................81.4.2发酵菌种的选择.................................................................................................................91.4.3液态发酵饲料的特性及在仔猪生产中的应用.................................................................91.4.4固态发酵饲料.....................................................................................................................91.4.5湿态发酵无抗全价料.......................................................................................................102引言.............................................................................................................................................133试验一湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能和血清生化指标的影响..............................143.1材料与方法..............................................................................................................................143.1.1试验材料...........................................................................................................................143.1.2试验动物...........................................................................................................................14I 3.1.3试验设计及日粮处理........................................................................................................143.1.4饲养管理...........................................................................................................................153.1.5湿态无抗发酵全价饲料的制作.......................................................................................153.1.6试验样品的采集...............................................................................................................163.1.7指标测定...........................................................................................................................163.1.8数据统计分析...................................................................................................................173.2结果与分析..............................................................................................................................173.2.1湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能的影响...............................................................173.2.2发酵全价料对断奶仔猪腹泻率和粗蛋白表观消化率的影响.......................................183.2.3发酵全价料对断奶仔猪血清生化指标的影响...............................................................193.3讨论..........................................................................................................................................213.3.1湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能的影响................................................................213.3.2发酵全价料对断奶仔猪腹泻率和粗蛋白消化率的影响................................................223.3.3发酵全价料对断奶仔猪血清生化指标的影响................................................................223.4小结..........................................................................................................................................244试验二湿态发酵全价料对断奶仔猪肠道发育的影响...........................................................254.1材料与方法..............................................................................................................................254.1.1试验材料...........................................................................................................................254.1.2试验动物...........................................................................................................................254.1.3试验设计及日粮处理........................................................................................................254.1.4饲养管理...........................................................................................................................264.1.5样品采集...........................................................................................................................264.1.6指标测定...........................................................................................................................274.2结果与分析..............................................................................................................................314.2.1发酵全价料对断奶仔猪粪样中微生物活菌数的影响...................................................314.2.2发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜形态结构的影响.......................................................324.2.3发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜二糖酶活的影响.......................................................36II 4.2.4发酵全价料对断奶仔猪肠道菌群的影响.......................................................................374.3讨论..........................................................................................................................................404.3.1湿态发酵全价料对断奶仔猪粪样中微生物活菌数的影响...........................................404.3.2发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜形态结构的影响.......................................................414.3.3发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜二糖酶活的影响.......................................................424.3.4发酵全价料对断奶仔猪肠道菌群的影响.......................................................................424.4小结..........................................................................................................................................435结论.............................................................................................................................................44参考文献.........................................................................................................................................45ABSTRACT....................................................................................................................................51III 河南农业大学2015届硕士学位论文摘要本文旨在基础日粮中加入不同比例的湿态发酵全价料，探讨其对断奶仔猪的生产性能、粗蛋白消化率、血清生化指标、小肠黏膜结构和二糖酶活、肠道菌群的影响。试验选取体况良好、体重为（8.20±0.16）kg的杜×长×大型断奶仔猪160头，随机分配于以下5种日粮（每组4个重复，每个重复8头猪）中：1）基础日粮＋20mg硫酸粘杆菌素+12mg恩拉霉素（抗生素组）；2）基础日粮＋0.1%枯草与地衣芽孢杆菌的复合型微生态制剂（微生态制剂组）；3）10%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮（10%发酵料组）；4）20%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮（20%发酵料组）；5）30%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮（30%发酵料组）。试验分成2个部分，结果如下：试验一：（1）与抗生素组和微生态制剂组相比，20%、30%发酵料组显著（P＜0.05）提高了仔猪的日增重；与抗生素组相比，发酵料组均显著（P＜0.05）降低了腹泻率，对料重比有一定的降低（P＞0.05）；各处理组在仔猪的日采食量方面无显著差异（P＞0.05）。（2）日粮中添加适量的发酵料可在一定程度上提高仔猪的粗蛋白消化率（P＞0.05）。（3）与抗生素组相比，10%、30%发酵饲料组可显著（P＜0.05）提高仔猪血清的球蛋白水平；30%发酵饲料组显著（P＜0.05）提高了IgM含量，而发酵料组均对其它血清指标无显著影响（P＞0.05），但能在一定程度上提高仔猪血清中总蛋白水平和免疫球蛋白含量。与微生态制剂组相比，20%发酵饲料组显著（P＜0.05）提高了仔猪的血糖含量；发酵饲料组均使血清尿素氮水平下降（P＜0.05），但其血清酶（谷丙/草转氨酶）活、甘油三酯和相应胆固醇的浓度无显著差异（P＞0.05）。试验二：（1）20%、30%无抗发酵全价料组较抗生素组和微生态制剂组提高（P＜0.05）了仔猪粪样中乳酸菌数，且发酵料组均减少（P＜0.05）了大肠杆菌数，对酵母菌数有一定的提高（P＞0.05）。（2）与抗生素组相比，发酵料组均增加（P＜0.05）了仔猪的空肠VH、VH/CD值，降低了十二指肠CD；且10%、20%发酵全价料组增加（P＜0.05）了仔猪十二指肠VH、VH/CD；20%、30%发酵饲料组能显著（P＜0.05）增加仔猪回肠VH、VH/CD和降低回肠CD；20%发酵饲料组显著（P＜0.05）增加了十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数。（3）与抗生素组相比，发酵料组均显著（P＜0.05）提高了仔猪空肠蔗糖酶活，且20%、30%发酵料组显著（P＜0.05）提高了十二指肠麦芽糖酶活，30%发酵料组显著（P＜0.05）提高了其空肠乳糖酶活。（4）微生态制剂组和10%发酵料组对仔猪直肠菌群的相似性影响较大，而20%、30%发酵料组则对其结肠影响较大；除20%发酵料组外各处理组结肠菌群的多样性指数均高于直肠，且抗生素组均低于发酵料组；抗生素组和微生态制剂组仔猪结肠菌群的均衡度和丰富度相对高于直肠，且抗生素组的均衡度和丰富度均低于发酵料组。结果表明，在日粮中添加适量的湿态发酵全价饲料在一定程度上可提高断奶仔猪的生产性能，修复受损的肠道黏膜，提高二糖酶活，并改善菌群的平衡状态，提高断奶仔猪的抗病1 河南农业大学2015届硕士学位论文力和抗应激能力。关键词：抗生素；微生态制剂；发酵全价料；断奶仔猪；生产性能；肠道发育；肠道菌群2 河南农业大学2015届硕士学位论文1文献综述由于在断奶阶段，仔猪的消化系统尚未发育完全，且机体内相关酶（尤其消化酶）活性较低，断奶会减少机体胃酸的分泌，破坏肠道菌群的平衡状态，引发一系列问题。为降低断奶应激所带来的损失，研究一种安全、高效且营养全面的饲料，能够适应和稳定仔猪肠道微生物菌群，提高其免疫力和抗病力，帮助仔猪快速适应环境和营养的改变就显得尤为重要。1.1断奶应激对仔猪肠道发育的影响仔猪断奶意味着其肠道黏膜形态要经历损伤-修复-成熟等复杂过程。而断奶期是其肠道发育的关键时期，因此阶段其肠道发育还处于未成熟状态，突然性断奶在某种程度上必将损害其肠道的健康[1]。1.1.1仔猪的断奶应激仔猪在胚胎—出生—突然性断奶等各个阶段中，经历了环境（恒温、无菌胎盘到多菌、变温猪舍）、心理（母子分离）和营养（液体母乳到固态料）等三大方面的变化应激。仔猪突然性断奶会减少其对来自母乳中的免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）等抗体和某些生长因子（GH、IGF、活性肽）的获得，降低了仔猪对外界的抵抗力。提早断奶易诱发一系列不良反应(应激综合征)，主要表现为食欲不佳、消化能力差、易出现腹泻、以及生长缓慢和发育迟缓等。1.1.2仔猪肠道发育仔猪主要依靠肠道（特别是小肠）黏膜来对营养物质进行消化和吸收，同时肠黏膜还可增强机体的防御能力。因而维护仔猪的肠道黏膜免受损伤对其健康生长就相当重要。1.1.2.1仔猪肠道的黏膜结构与功能仔猪主要在小肠对营养物质进行消化吸收，同时小肠还具有强大的免疫功能。根据结构特征小肠壁由内而外可分为：黏膜层（包括上皮、固有层和黏膜肌层）、黏膜下层、肌层（内环肌和外纵肌）以及外膜。动物主要依靠小肠的黏膜来进行养分的摄取。肠壁膜与黏膜下层一起突入肠腔所形成的环形皱襞上附有的许多指状突起即为肠绒毛，它主要由上皮（单层柱状上皮）和其中的固有膜组合而成，上皮之中附有大量的柱状细胞（分泌粘液），且此上皮细胞的顶端附有由许许多多的微绒毛密集而成的纹状缘。小肠的绒毛和隐窝是其所具有的功能性单位，绒毛的上皮细胞在隐窝处呈分泌性，在其转移至绒毛的旁侧，生长并成熟而形成吸收细胞后，微绒毛就会变得又细又长又多[2]。倘若绒毛的顶端处遭到破坏，成熟的吸收细胞将会减少或丢失，而诱使不成熟的隐窝细胞出现净分泌现象，导致绒毛细胞进一步地更新，严重影响动物的消化和吸收。而绒毛若发生萎缩在一定程度上将会使黏3 河南农业大学2015届硕士学位论文膜受到损害，缩小了对养分的吸收面积，从而降低动物的消化和吸收力度[3]。小肠的黏液屏障和细胞屏障共同形成了完整的黏膜屏障[4]。糖蛋白在小肠黏膜所附有的吸收细胞与潘氏（黏液）细胞作用下构成了一道黏液层，其主要作用为：①可为肠道创造适宜的酸性环境（PH）；②可保护肠黏膜免受有机酸和蛋白酶的侵害；③在运动过程中起润滑作用，可降低其受损伤的力度；④可有效减少肠道有害微生物对黏膜的损伤；⑤黏液层还可将机体内的微生物菌群、消化酶、胆汁等进行降解，从而增加抗原的吸收和微生物在机体的粘附，为正常的菌群创造适宜的生存环境[5]。同时肠上皮细胞间彼此的紧密连接在某种程度上可有效抑制病原菌、抗原等一些大分子物质对机体的侵害。1.1.2.2仔猪肠道内菌群的组成结构与分布仔猪对养分的消化与吸收大都在小肠进行，且定居在其肠道内的菌群结构比较复杂。十二指肠由于易受胃酸和胆汁的影响，食物在其内停留时间较短，微生物数量相对较少，每克食糜中含有的总菌群数为107cfu。而小肠后部的内容物较多，迁移就相对缓慢，微生物数就相对较多，每克内容物中所含有的总的菌群数为108~109cfu[6]。大肠是菌群寄居较多的场所，因大量内容物滞留、肠蠕动较慢，就提供了有益于菌群繁殖的营养环境。据相关报道统计用传统平板培养计数法测得小肠肠腔中每克内容物(湿重)所含不同菌群的活菌数为：空肠内酵母菌、类杆菌、肠球菌、大肠杆菌、消化球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌等依次为：（2.1±0.4）、（2.8±0.4）、（4.9±1.5）、（5.7±1.3）、（5.8±1.2）、（7.2±0.7）、（7.3±0.6）；回肠内酵母菌、类杆菌、肠球菌、大肠杆菌、消化球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌等依次为：（2.4±0.8）、（5.3±1.1）、（6.0±1.1）、（6.1±1.6）、（6.2±1.4）、（7.4±0.6）、（7.6±0.8）[7]。盲肠中菌群的分布：占主导地位的有乳酸杆菌、双歧杆菌；其次有消化球菌、大肠杆菌、类杆菌，少数为肠道球菌、酵母菌等。研究表明肠道微生物区系还与猪的品种、日龄及饲养环境等密切相关。猪肠道内的优势细菌菌群主要为：乳酸杆菌、双歧杆菌、粪屎肠球菌等。乳酸杆菌是猪肠道中作用最大且研究最多的菌群，它在仔猪出生5~6天后开始占主导地位。乳酸杆菌在直肠的数量较多，其次数空肠，直肠中食糜所含乳酸杆菌数量为109.4cfu/g[8]。双歧杆菌是肠道内普遍存在的一类细菌，动物自出生数小时后就可以在肠道定植，1~2周双歧杆菌数量迅速增长并成为优势菌群，且于动物小肠前段不易发现，而于其后段含有103~105cfu。粪屎肠球菌是猪肠道正常菌群之一，从动物出生后就在肠道定居，是一种需氧菌，在猪肠道中居第二位仅次于大肠杆菌。在正常动物的肠道中，微生物、宿主（动物机体）以及环境共同构成了一个和谐、平衡的微生态体系，大量的微生物能够适应动物肠道内的生存环境，促进肠道发挥正常功能，一旦肠道菌群平衡遭到破坏，致病微生物就会趁机侵入从而诱发某些肠道疾病[9]。总结大量动物肠道微生物菌群方面的试验研究，发现菌群的分布规律为：由于受饮水、补料以及自身消化液分泌等诸多因素的影响，动物前段消化器官（口腔、食管、胃、十二指肠前段）4 河南农业大学2015届硕士学位论文中细菌的种类和数量就会经常呈现较大的波动状态；而外界变化很少会干扰到消化道下部处的内环境，故肠道后段菌群会趋于相对稳定，从而与动物机体保持一种稳定的共生关系。此外，双歧杆菌或厌氧型乳酸杆菌等原籍菌主要寄居在肠道黏膜的深层处，而类杆菌与消化链球菌主要在肠道黏膜中层发挥作用，肠杆菌和肠球菌等外籍菌则在肠道黏膜表层处占优势，这些菌群共同构成了一个完整的微生态系统[10]。1.1.2.3仔猪肠道微生物菌群自身的调节机制由于动物的下消化道（结肠）菌群与粪样菌群相差不大，故可以根据所采集的粪样标本进行肠道菌群结构的分析，进而深入探索其菌群（通常需了解类/双歧/乳酸/肠杆菌和肠道球菌的组成和分布情况）的变化规律[11]。同时，虽然动物的整个肠腔中驻足了许多的细菌，但通常情况下它们会保持平衡状态，不会引发疾病。因而，可通过研究健康动物粪样中优势菌群的组分而进一步分析动物在病理状态下菌群的变化情况。健康动物正常菌群自身可能的调节机制为：（1）进入肠道的细菌大部分会被其分泌的胃酸所杀灭，能使其浓度维持在较低水平。（2）大肠的蠕动可以将大量细菌推向肠腔下段。（3）肠道自身所分泌的胆汁酸、溶菌酶等具有抑菌作用。（4）微生物菌群之间的相互协同作用，可以促进专性厌氧菌的生长和繁殖，而有些细菌之间具有拮抗作用，能够抑制有害菌的侵入和生长，从而维持了菌群的平衡状态。（5）动物肠道中部分微生物在代谢过程中生成的乳酸等有机酸类，可促使PH下降，从而增加乳酸菌等益生菌的数量。1.1.3断奶应激对仔猪肠道健康的影响大量试验研究表明，仔猪断奶后由于其细胞凋亡的速度加快而更新的速度减慢将会导致其小肠组织和黏膜相对重量降低，并出现小肠绒毛的严重萎缩和隐窝的加深等变化。这是因为仔猪遭受应激后会出现一系列的过敏反应，加快了肠细胞的分裂速度，绒毛顶端肠细胞的脱落会随着肠细胞向绒毛的迁移速率的加快而增加，从而加剧了成熟肠细胞的损伤力度[12]，同时细胞更新的速率在一定程度上会诱使未成熟的细胞被不同功能的细胞所替代[13]。因此，肠黏膜上皮细胞数的减少会促使肠道绒毛发生萎缩。研究表明断奶应激会诱使仔猪小肠出现绒毛变短、隐窝凹陷等退化现象[14-16]。由于仔猪肠道的部分消化功能和全部吸收功能都是依靠肠道绒毛和隐窝来实现的，而断奶应激很大程度上影响了肠道绒毛高度和隐窝深度，降低了仔猪的消化和吸收功能，从而在一定程度上制约了仔猪的快速生长和损害其健康。仔猪突然性断奶会破坏其肠道黏膜的完整、增大其通透性与上皮基底面，促使肠腔内的有害物质有机可趁侵入到亚上皮的组织和黏膜肌层处，诱发一系列炎症等疾病，从而加大了损伤力度并引发继发性感染。因而需要在仔猪饲料中添加一些能改善其肠道黏膜结构并促进其修复的寡肽类、生长因子类、抗微生物肽类抑或相关代谢调节剂等添加剂类物质。Boudryg等（2004）试验研究表明仔猪小肠结构的损伤和重建需要长期的过程，而这个过程也是其肠道从发育到成熟的重要过程。5 河南农业大学2015届硕士学位论文仔猪肠道微生物生存的物理环境会影响其菌群的平衡状态，一般仔猪断奶后肠道PH升高会促进大肠杆菌的繁殖，而抑制乳酸杆菌的生长，这可能是由于肠道有益菌喜好在偏酸性环境中生长，而肠道致病菌则更适合在弱酸偏碱性条件下繁殖的缘故。有研究阐明断奶2天时仔猪回肠食糜所含的乳酸杆菌会明显降低（相当于零），大肠杆菌数则随其PH增高而增多[17]。1.2抗生素扰生素是一种代谢产物，它能遏制或杀灭细/真菌、立克氏体、支原/衣原体等众多微生物菌群。而饲用型抗生素就是在动物日粮中以辅助治疗的形式添加，从而维护其肠道健康、提高其生长速度和消化率的一种添加剂[18]。自20世纪40年代问世以来，抗生素在提高动物生产性能和预防腹泻等方面效果显著，但其在带来巨大经济效益的同时也引发了许多严重的问题。1.2.1抗生素促进动物生长的机理1）可抑制细菌的生长或将其杀灭：在一定水平上能抵制病原菌对肠道的入侵，增强其抗病力[19]；2）缩小肠道黏膜的厚度，从而增加黏膜的通透性，促进营养物质的吸收；3）能激活体内酶的活性，增强动物机体的抗病力；4）在一定条件下可刺激下丘脑和垂体发挥作用，进而使生长激素分泌增多，提高动物的生长性能。1.2.2使用抗生素所带来的负面效应1）会诱使细菌产生抗药性。抗生素以一定的剂量使用一段时间后易产生剂量效应，需加大所用剂量才能达到预期效果，但其抗药性跟作用区域有关；停止使用相应抗生素后抗药性会降低但再次使用时抗药性又会迅速上升。2）大剂量使用会产生药物残留，从而不同程度地影响了肉、蛋、奶产品的质量，危害了人类的健康。3）使用抗生素在一定程度上会破坏动物肠道微生物菌群的平衡。4）长期投用将减弱动物的免疫机能，影响其生长性能。5）大剂量使用抗生素后会干扰抗原作用，影响疫苗的免疫效果，促使动物产生不良反应。6）滥用抗生素会诱发内源性或再次感染等并发症[20]。1.2.3抗生素在应用时需注意的问题尽管当下已提出要大力减少抗生素的使用甚至不用，但目前养殖户用抗生素治疗动物6 河南农业大学2015届硕士学位论文疾病还较多见，同时由于过度添加，导致畜禽生产对抗生素产生较大的依赖性。故为了降低抗生素在生产上所带来的不良后果，在使用时需注意以下几方面问题：1）合理科学选用并严格掌握各类抗生素的适应症，选用安全系数高、抗菌作用强且无毒副作用的抗生素类添加剂。2）全面综合考虑动物的品种、日龄等对其作用机理的影响，从而选择适宜的种类、剂型或剂量、给药途径与疗程等，以保证抗生素的最佳效果。3）要遵从并合理地使用国家法定药物。4）在给动物用药时需注意说明书上的使用期和停药期，以确保将动物产品中抗生素的残留降低到允许的范围内或最低水平，从而保证食品的健康和安全[21]。1.3微生态制剂微生态制剂是结合动物机体相关生理与营养理论，将其体内所含的正常微生物菌群成分与相应代谢产物或促生长物质通过特殊处理（活化-发酵-烘干等）而制成的活的制剂，且在机体中无污染、无残留和无毒副作用，从而阻止致病菌的入侵，为菌群的健康生长提供有利条件，进而改善了其菌群的平衡状态[22]。1.3.1微生态制剂的组成及作用机理根据所属类型微生态制剂可分为益生菌、益生元和合生元三大类。益生菌：可改善动物肠道的菌群状态并促进宿主生存且具有活性成分的一类添加剂；益生元包含低聚糖类、（生物）促生长制剂类和中草药调节剂类等，它通过增强动物结肠中常见菌的繁殖和提高其比活力，可调节宿主未分解的正常食物的成分；合生元（合生素），则是将前两类同时合在一起使用的一类制剂。现今常作为微生态制剂的有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、光合细菌等几类菌种。2008年我国农业部批准允许投入使用的有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪链球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、乳链球菌等16种菌种。微生态制剂能改善动物肠道的菌群结构、酸度、相关酶活和肠黏膜形态，进而维护肠道健康。其作用机理为：1）能充分利用胃肠所含氧气致使机体氧含量降低，有利于厌氧菌的繁殖，进而改善了肠道菌群的平衡状态。2）通过维持肠道优势菌群的竞争力，遏制了病原微生物及有害代谢产物对肠道的侵害，有力地维护其健康。3）该类菌种可有效运用其特有成分（肽聚糖）进而去诱导免疫细胞发挥作用，使免疫球蛋白的含量和巨噬细胞的活性有了很大提高，促使非特异性免疫因子等对机体的免疫性和抗病力增强，更好地维护了机体健康。Lessard等研究表明益生菌在一定水平上能增加仔猪肠道内的淋巴细胞数和提高了IgA水平，增强了仔猪肠道的免疫功能，从而有效抑制了大肠杆菌对肠道的损害[23]。4）附着于微生态制剂中的那些有益菌一方面能促进机体对营养物质的吸收，另一方面其在代谢过程中还会产生大量的消化酶以及乳酸和脂肪酸等抑菌性物质，既提高了动物对饲料养分的消化和吸收，也更好地维护了动物肠道菌群的平衡，促进了肠道的健康。1.3.2微生态制剂在断奶仔猪生产中的应用7 河南农业大学2015届硕士学位论文微生态制剂属于一种新型的绿色-环保型类添加剂，不仅能提高饲料的利用率，还可有效维护仔猪肠道菌群的稳定状态，增强其抵抗力，进而促进了动物的生长和降低其腹泻率。有研究在饲粮（不含抗生素）中投放适量的微生态制剂，发现断奶仔猪的饲料利用率有了很大提高和料重比也相应降低[24]。黄兴国等[25]试验发现，在日粮中添加一定量的微生态制剂后，试验组生长猪粪样中的大肠杆菌含量明显少于对照组，且乳酸菌和双歧杆菌含量也有了相应的增加。李吉祥等[26]在日粮中加入一定比例的酶制剂、微生态制剂以及两者的混合物发现，断奶仔猪的增重和饲料利用率都会提高，减少了仔猪腹泻的发生，降低了饲料成本。梁明振等[27]给仔猪饲喂含有益生菌日粮的研究发现，仔猪血清总蛋白的含量明显增加和血清尿素氮含量则相应减少。同时，微生态制剂可以在一定水平上增加仔猪小肠黏膜的VH，并明显增大VH/CD[28]。这与黄俊文等[29]的研究结果相一致，他们通过给早期断奶的仔猪饲喂纳豆菌，发现可显著改善仔猪断奶后的小肠黏膜绒毛的发育状况。以上研究均表明微生态制剂在一定水平上可促进仔猪的生长，维护其肠道结构的完整和健康。1.3.3微生态制剂在运用时需注意的问题微生态制剂在调节动物肠道菌群平衡、促进动物健康生长、提高饲料转化率和动物免疫力方面具有很大意义，它绿色安全，具有抗生素所不具有的特点，是替代抗生素较有潜力的一种添加剂。尽管微生态制剂的应用前景比较广阔，但在使用时还需注意以下几方面问题：1）微生态制剂菌种的活菌数和使用剂量的选择。我国对允许应用于生产的相关菌群的总活菌数与添加量有明确的规定：芽孢杆菌≥5×108个/g，乳酸杆菌≥1×107个/g。添加量取决于该制剂的类型功能、动物的生长发育特征以及体况等。2）饲喂方式的选择。由于微生态制剂的种类较多，其饲喂方式应根据其品种而定；倘若近期已用过抗生素了，就不能再连着使用该制剂了，因饲料所含有的成分会对其产生干扰；那些肠道菌微生物结构已遭到损伤的动物，可先用抗生素缓解病情后再用该类制剂。华均超与张邦辉的试验研究报道，采用不同的用药方式（连续性/阶段性/一次性）其功效会有很大差别，唯有结合微生态制剂相应菌种的某些特性实行安全可靠的措施来合理搭配，方可达到预期的疗效[22]。1.4发酵饲料1.4.1发酵饲料的特性发酵饲料，就是借助微生物在饲料原料中的生长繁殖和新陈代谢作用，积累可利用的菌体物质、相关酶和中间代谢产物进行特殊处理，改变饲料的理化性状，改善其适口性和营养价值，从而使饲料的转化率得到提高的一种生物发酵饲料[30]。微生物在饲料发酵过程中会生成各种酶类，促使原料中那些大分子复杂物降解成易消化的小分子营养物质或形成8 河南农业大学2015届硕士学位论文菌体蛋白，极大地提高了饲料的营养价值和利用率；同时还可释放出有机酸、抑菌物质、活性肽等具有活性成分的物质，可提高动物机体的抗病力，改善了动物肠道的微生态平衡，提高了畜禽产品的质量；此外还能产生各种具有活性的益生菌能改善动物的健康状况、增强动物的免疫力，降低养殖成本。因此，发酵技术为饲料资源研发与应用提供了很大的参考价值。1.4.2发酵菌种的选择中国的微生物资源种类繁多，其中常用于工业发酵的菌种主要包括细菌类、酵母菌类和霉菌类等。细菌类主要有芽孢杆菌类（枯草/地衣/纳豆型等）、乳酸杆菌、醋酸杆菌等；酵母菌类主要为啤酒/假丝/红酵母等；霉菌类主要有黑/米曲霉、白地/木霉等[31]。植物蛋白质饲料常用的发酵菌种主要有枯草/腊样芽孢杆菌、米/黑曲霉、假丝/酿酒酵母、乳酸菌等。乳酸菌在发酵时会产生一定的乳酸，从而有效遏制了有害菌的生长和繁殖，改善饲料的品质。芽孢杆菌在发酵饲料中主要以芽孢的形式存在，进入动物肠道后会消耗大量的氧气，创造一种酸性环境，提高动物抗病力；还能释放出具有活性作用的抑菌类物质，增强动物的免疫力；同时芽孢杆菌能够产生B族维生素（主要为VB1、VB2、VB6）、VC，生成多种消化酶（蛋白/淀粉/脂肪酶等），提高饲料的营养价值和养分消化率。酵母菌类蕴含大量的营养物质（蛋白质类、B族维生素类、脂肪类、糖类、酶类），可提高饲料的适口性。因此，益生菌类物质可提高动物对日粮中总蛋白的消化率[32]；益生菌类发酵饲料可提高动物的免疫力和促进其生长，降低了断奶应激所造成的损失[33]。1.4.3液态发酵饲料的特性及在仔猪生产中的应用液态发酵就是将微生物在生长繁殖过程中所需的糖类、无机盐和另外一些营养素混匀后拌入水里制成培养基，然后向其中通入无菌空气并加以搅拌充氧，然后保证微生物在适宜的温度环境中培养与繁殖的过程[34]。液态发酵饲料是现今一种新型环保、高效的饲料，它能提高动物对饲料的消化率，从而提高了畜禽的生产性能，缓解了仔猪的腹泻状况。Hong等[35]通过将液态发酵饲料饲喂仔猪来改善其生长性能的试验研究发现，仔猪的日增重、采食量分别提高了13%、6%，料重比降低了5%，但无明显差异。Scholten等[36]在研究发酵小麦液体饲料对28d断奶仔猪的影响的试验中，通过测定仔猪（断奶第1d、4d、8d三个阶段）胃肠道中有机酸（乳酸、乙/丙/丁酸等）的酸度与浓度来研究液态发酵料对仔猪胃肠道发育的影响，试验发现在仔猪断奶第4d时其胃中PH变小，乳酸浓度明显增大，肠道绒毛长度有所增加，表明液态发酵料能有效改善断奶仔猪的肠道黏膜形态，保护其结构免遭损伤。1.4.4固态发酵饲料1.4.4.1固态发酵饲料的特性9 河南农业大学2015届硕士学位论文固态发酵是将发酵基质接种到含有少量游离水的固态湿培养基上进行发酵的过程，其有益微生物在发挥作用时所分泌的酶系能将大分子营养成分分解成易于消化吸收的小分子营养素。固态发酵饲料就是借助微生物的特异作用而转变饲料原料的理化特性进而促使饲料的可利用率增加，并延长饲料的存放期；或转废成宝，把秕壳残渣加工成饲料；或去除饼粕中的毒性成分加工处理成安全类饲料。根据发酵基质的成分可将固态发酵饲料分成：发酵全价料、发酵浓缩料、发酵豆粕和其他发酵类产品。1)发酵全价饲料：将全价饲料作为基质，向其中依次加入水和微生物菌种，混匀后在适当环境温度条件下经适宜的时间通过厌氧或好氧或者是先好氧后厌氧发酵而成的酸香味饲料。这类饲料富含大量的有益微生物在满足动物生长需要的前提下，还可增加饲料中的小分子蛋白、有机酸、维生素以及氨基酸等的浓度，它具有良好的促生长和促进肠道健康的作用。2）发酵浓缩料：分别把微生物和水以适宜的比例混匀后接种于浓缩料中通过相应时间的发酵加工而成的饲料，称为非全价料，与发酵全价料相比其缺少能量饲料，而功能基本相似。3）发酵豆粕：以豆粕原料为底物，通过微生物的特异功能作用，降低或消除豆粕中的胰蛋白酶、大豆抗原等抗营养因子，并产生许多富含小分子营养物质和消化酶的蛋白饲料。4）其它种类发酵饲料：包括以酵母活细胞或代谢产物为主的发酵饲料；棉粕、菜籽粕、花生粕、米糠粕等杂粕类发酵饲料；豆渣、啤酒渣以及水果渣等渣滓类发酵饲料等。1.4.4.2目前固态发酵料在应用中尚存在的问题尽管当前已有不少关于固态发酵技术在开发饲料资源方面的研究，并取得很大进展，但还需解决以下几方面问题：（1）发酵工艺尚不完全成熟，还有待改进。因为目前的研究多以实验室这种小规模的发酵研究为主，而实际的应用经验告诉我们，实验室的小规模发酵生产出来的产品与大规模化生产有很大的区别。单纯的实验室小规模试验研究出来的技术参数，在大工厂化生产中并不一定可行。（2）发酵设备不够完善。此种发酵所运用的通风设备是保证好氧菌完成发酵的一种关键设施，国内仍主要以传统开放模式为主，尽管一些生产商对反应器的性能以及配件的可操作性方面已有不同程度地改进，但反应器的体积较小，不太符合现代推行的将酿造技术转向规模化、保证生产出高效、高品质产品的发展趋势；同时设备投资较大，投资的成本相对较高，相应的工艺参数还需进行最优化设计[37]。（3）所用菌种的性能还有待改进。许多菌种的发酵性能尚达不到所需产品的要求，发酵后原料的产品性能还不够稳定，有些可能尚达不到饲料行业的使用要求标准。同时，菌种的复配技术仍缺乏一套完整的理论体系来支撑，对菌群之间的相互作用机理研究得还比较少，缺乏成熟可靠的科学理论去指导实践。在今后的试验研究中，还需要深入研究和探讨并找到一种成熟稳定且安全可靠的发酵工艺来提高饲料产品质量，降低生产成本。1.4.5湿态发酵无抗全价料10 河南农业大学2015届硕士学位论文1.4.5.1湿态发酵无抗全价料的研究背景抗生素自20世纪40年代问世以来，在动物促生长和防治疾病方面发挥了重要作用，但由于过量或不合理使用给生产也带来了许多的问题。为此人们开始极力寻找安全可靠的抗生素替代品来缓解这种局面，益生菌和微生态制剂在提高动物的生长性能和增强抗病力方面取得了很好的效果[38]，逐步得到认可。而复合型益生菌固态发酵无抗全价料则是通过结合此两种制剂的功能研制而成的新型饲料，其是通过将那些具有特殊功能的有益微生物（菌种或菌液）与基础全价饲料（无药物）混匀后在适宜条件下发酵完全再经干燥抑或制粒、包装等特殊的处理后加工而成的具有活性有益菌成分或代谢产物的一种绿色、安全、高效的生物饲料[39]。固态发酵全价料根据其加工程序不同可分为湿态（半干态）发酵全价料和（全）干态发酵全价料。湿态发酵全价料是指将发酵液直接接种于基础全价料中待发酵完全后直接包装而成的发酵饲料，而干态发酵全价料则比其多了一步烘干工序。目前在猪生产方面，特别是对断奶仔猪，我国主要采用全干料、湿拌料、液态料等饲喂方法，但相对使用较多的还数全干料饲喂法，而对于国外那些先进国家早在二十世纪后期就已开始试着以湿拌料抑或液态料的形式喂养猪了，同时也取得了较好的饲喂效果，而我国在此方面的研究报道还相对较少[40]。1.4.5.2湿态发酵无抗全价料在断奶仔猪生产中的应用仔猪断奶前主要靠摄取母乳中的营养物质来满足其自身的生长需要，同时其肠道中的乳酸菌可将乳汁中的乳糖转化成有机酸如乳酸，有效降低了肠道的PH，维护了肠道免受大肠杆菌等有害菌的侵害；仔猪断奶后，饮食主要由易吸收的液态母乳转换成了难消化的粗干料，在很大程度上降低了其采食量，且此时肠道补充的淀粉不能转化成乳酸，从而导致PH升高，不利于有益微生物的生存，促使大量致病菌增多而诱发腹泻等症状[41]。而用一定比例的湿态发酵无抗全价料替代部分基础全价料，能将摄进肠道中的淀粉转换成乳酸，创造了有利于微生物生长的酸性环境，在提高仔猪采食量和生长速度的同时也降低了其腹泻率，维护了肠道菌群的平衡和健康，从而更好地缓解了断奶应激。马广等[42]试验研究发现，固态发酵全价料能够显著提高8～100kg阶段仔猪的日增重和降低其料重比。吕锋等[43]试验结果也与此相似。王俊锋等[44]在育肥猪日粮中加入一定比例的发酵全价料，结果其体重和饲料利用率都得到了增高。邱涓[45]的试验表明，无抗发酵料组仔猪的日增重较常规饲料组有了很大增加，且其采食量与料重比也相对较优。发酵饲料之所以能提高动物的生产性能，可能跟其营养特性和发酵后所产生的活性成分有关，饲料原料通过益生菌的代谢作用可将结构复杂的营养物质分解为简单的、易消化的物质；同时发酵饲料所含有的益生菌在进入动物肠道后会被快速活化过来并产生多种消化酶和乳酸等，改善了肠道菌群的平衡，在一定程度上也提高了饲料的利用率[46]。此外，袁国伟等[47]在仔猪料中加入20%的固态发酵酶解饲料替代鱼粉和乳清粉进行一段时间的试验研究发11 河南农业大学2015届硕士学位论文现，断奶后0～15d和31～45d仔猪的腹泻率分别显著降低了23.87%、29.51%；日采食量显著提高了10.83%，但各组料重比无明显差异。与此一致，魏金涛等[48]使用固态发酵饲料代替颗粒料饲喂仔猪时发现，与颗粒料相比，发酵饲料能显著降低仔猪的料重比和腹泻指数，日增重有所提高，但差异不显著。王娟娟等[49]在仔猪的日粮中添加10%无抗发酵料，发现可提高其血液中IgA的含量和增强抗应激能力。虽然发酵技术在生产中已取得了很大的研究进展，但湿态发酵无抗全价料在断奶仔猪上应用的研究报道相对较少，对于成熟发酵工艺参数的确定以及发酵后质量的保障等方面还需进一步探讨和研究，以便在降低发酵成本的基础上生产出绿色、安全、高效的生物发酵饲料。12 河南农业大学2015届硕士学位论文2引言在这科技突飞猛进、社会不断发展和生活质量日益改善的年代，人们更加注重身体健康，也就越来越追求更优质的畜禽肉、奶、蛋等食品。所以，在集约化养殖中生产出新型、绿色、无公害的生物饲料将成为未来饲料行业的研究热点和发展方向。微生物发酵饲料是生物饲料的一个重要组成部分。现今将豆粕、菜籽粕、棉粕、花生粕等饲料原料进行发酵并应用于猪生产方面的研究报道相对较多，而微生物发酵全价饲料，尤其是关于湿态发酵无抗全价料对断奶仔猪肠道形态以及肠道菌群的影响方面的研究还相对较少。本文旨在基础日粮中加入适量的抗生素与微生态制剂以及不同水平的湿态发酵全价料探讨其对断奶仔猪的生产性能、粗蛋白消化率、血清生化指标、小肠黏膜结构与二糖酶活以及肠道菌群的影响。旨在为研发出品质优、无污染、无残留或无毒副作用的特色微生物发酵料及其在猪生产中的应用提供科学的理论依据。13 河南农业大学2015届硕士学位论文3试验一湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能和血清生化指标的影响3.1材料与方法3.1.1试验材料发酵所用菌液由山东农科院微生物研究所提供，主要成分为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、酿酒酵母菌等，活菌数≥20×108CFU/mL。枯草与地衣复合型微生态制剂由山东农科院微生物研究所提供，活性成分为200～2000×108/g。硫酸粘杆菌素和恩拉霉素等抗生素由河南碧云天饲料有限公司提供。3.1.2试验动物选择体况良好、体重为（8.20±0.16）kg的“杜洛克×长白×大白”断奶仔猪160头，随机分为5组，每组4个重复，每个重复8头仔猪，于2014年11月12日至12月14日在河南省禹州市鸿畅镇发群种猪场进行试验，其中预试期5d，正式期28d。3.1.3试验设计及日粮处理试验采用单因子随机区组设计分为5种日粮：1）基础日粮＋20mg硫酸粘杆菌素+12mg恩拉霉素（抗生素组）；2）基础日粮＋0.1%枯草与地衣芽孢杆菌的复合微生态制剂（微生态制剂组）；3）10%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮；4）20%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮；5）30%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮。抗生素为在每千克预混料中添加20mg硫酸粘杆菌素+12mg恩拉霉素。基础日粮参照美国NRC2012年猪营养指南推荐水平配制而成。饲粮配方见表3-1。14 河南农业大学2015届硕士学位论文表3-1试验基础日粮组成和营养水平（风干基础）Table3-1Ingredientcompositionandnutrientlevelofbasaldiet（air-drybasis）原料Ingredient含量Content%营养水平Nutrientlevel含量Content%玉米Corn48消化能DEMJ/kg20.2全脂大豆Full-fatsoybean14粗蛋白CP14.43发酵豆粕Fermentedsoybeanmeal8钙Ca0.82乳清粉Wheypowder11总磷TP0.63鱼粉Fishmeal4有效磷AP0.41大豆浓缩蛋白Soyproteinconcentrate3赖氨酸Lys1.45乳脂粉Fatpowder3蛋氨酸Met0.44豆粕Soybeanmeal3蛋+胱氨酸Met+Cys0.76大豆油Soybeanoil2苏氨酸Thr0.94磷酸氢钙CaHPO41色氨酸Trp0.26石粉Limestone0.5乳猪预混料（2.5%）Premix2.5合计Total100注：1、预混料为每千克饲粮提供Thepremixprovidedthefollowingperkgofdiets:VC257mg,VE50mg,猪用多维Vitaminpremixforpigs450mg,Fe150mg,Zn180mg,Cu50mg,1.0%酵母铬1.0%chromiumyeast75mg,抗氧化剂antioxidant94mg,防霉剂anti-mold219mg,乳酸宝AcidLac5000mg,氯化胆碱choline375mg,叶酸folicacid0.1mg,烟酸niacin75mg,生物素biotin0.375mg,精盐refinedsalt2875mg。2、粗蛋白、钙、总磷为测定值，其它为计算值。CP,CaandTPwereanalyzedvalues,whiletheotherswerecalculated.3.1.4饲养管理试验仔猪于（23±2）d断奶，在断奶当天先赶走母猪，仔猪留原圈饲养一周后转入保育舍。然后采用分栏饲养，一个重复一栏，仔猪自由采食和饮水，每天分别在06:00、09:30、13:00、16:30和20:00定点进行饲喂，少喂勤添，每天清扫被溢出料槽或吃剩的料并称好重，遵照所在猪场的正常免疫程序开展免疫，保持良好的通风与换气，保证平均舍温在（24±2）℃，湿度在60%～75%。3.1.5湿态无抗发酵全价饲料的制作发酵全价饲料是在河南禹州发群种猪场制作，发酵菌液由山东农科院微生物研究所提供。制作工艺：先将称好的200kg的全价颗粒料倒在干净的地面上，然后按照0.2%的接种量和1:0.2的料水比标准，将400mL发酵液倒入39.6L的40℃温水中混匀后喷洒在饲料上，并将饲料放入混合机中搅拌均匀，最后装入发酵袋中密封好放在25～35℃（最适宜温度为15 河南农业大学2015届硕士学位论文35℃）的环境下发酵。一般每周发酵一批，7d发酵完全即可饲喂。全价料发酵前后相关指标的测定结果见下表。表3-2饲料发酵前后其微生物活菌数及相关成分含量（风干基础）的变化Table3-2Changesofmicrofloranumberandrelevantcomponent(air-drybasis)beforeandafterfeedwerefermented项目Item全价饲料Completefeed发酵全价料Fermentedcompletefeed乳酸菌Lacticacidbacteriacfu/g6.8×1048.7×107酵母菌Yeastcfu/g6.7×1038.6×105酸溶蛋白Acidsolubleprotein%3.453.90水溶蛋白solubleprotein%4.454.85表3-3各处理组全价日粮的营养水平（风干基础）Table3-3Thenutrientlevelofcompletedietusedfortreatmentgroups（air-drybasis）添加不同比例的发酵全价料组Addingdifferentlevelfermentedcompletefeedgroup项目Item010%20%30%消化能DE（MJ/kg）14.4314.4214.4114.40粗蛋白CP%20.220.2320.2720.3风干物质DM%8685.6585.384.95钙Ca%0.820.840.860.88总磷TP%0.630.630.630.62有效磷AP%0.410.410.410.423.1.6试验样品的采集3.1.6.1粪样的采集和处理方法在试验第25、26、27天，分别以圈舍为单位每天采集新鲜粪样100g于自封袋中，并加入10%的稀硫酸10mL，保存于-20℃冰箱中，然后将这3天连续收集的粪样以圈舍为单位混匀，于烘箱（65±2）℃中烘48h再在室内晾24h，将样品粉碎过40目筛后保存以用于粗蛋白表观消化率的测定。3.1.6.2血样的采集和处理方法在试验27天时，从每个重复中各取一头体况健康的试验猪，从前腔静脉处采10mL血，静置2h后离心析出血清，保存在-20℃冰箱里备测。3.1.7指标测定3.1.7.1发酵料中活菌数的测定采用平板计数法测发酵饲料中乳酸菌和酵母菌的活菌总数。16 河南农业大学2015届硕士学位论文3.1.7.2发酵饲料水溶蛋白的测定将发酵料样品经蒸馏水溶解静置、过滤并离心处理后，将上清液移入消化管中进行消化、蒸馏，按照凯氏定氮法测定水溶蛋白含量。3.1.7.3发酵料酸溶蛋白的测定将发酵料样品用15%三氯乙酸溶液溶解处理，静置、过滤、离心后，按照凯氏定氮法将上清液转入消化管中进行消化、蒸馏、滴定，测定酸溶蛋白含量。3.1.7.4仔猪生产性能的测定分别在试验开始的当天和最后一天早上称取空腹状态下仔猪的初始重与末重；并记录每个重复仔猪的采食量和剩余料量。ADG=(终末体重-初始体重)/（试验天数×试验仔猪头数）。ADFI=(总喂料量-剩余料量)/（试验天数×试验仔猪头数）。F/G=日均采食量/日均增重。3.1.7.5腹泻率每天于早、晚记录仔猪的腹泻情况。腹泻率（%）=[（仔猪腹泻头数×腹泻天数）/(仔猪总头数×试验天数)]×100。3.1.7.6粗蛋白消化率的测定用凯氏定氮法测定饲料和粪样中的含氮量，并换算成粗蛋白质含量，利用盐酸不溶灰分法（内源指示剂法）测定饲料和粪样中酸不溶灰分含量。粗蛋白质表观消化率（%）=[1-（a*×n*）/（b*×m*）]×100。a:粪样中粗蛋白质含量;b:饲料中粗蛋白质含量;m:粪样中酸不溶灰分含量;n:饲料中酸不溶灰分含量.3.1.7.7血清生化指标的测定血清在郑大附属第二人民医院，采用西门子全自动生化分析仪测定血清中尿素氮、葡萄糖、总蛋白、白蛋白、球蛋白、甘油三酯、总胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白以及IgG、IgA和IgM的含量。3.1.8数据统计分析试验数据以重复为单位，采用Spss20.0统计软件对各指标进行单因素方差分析和Duncan多重比较，显著水平为P<0.05，结果表示为“平均值+标准差”。3.2结果与分析3.2.1湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能的影响17 河南农业大学2015届硕士学位论文表3-4湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能的影响（kg）Table3-4Effectsofwetfermentedcompletefeed(FCF)onperformanceinweanedpiglets(kg)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF初始重Initialweight8.26±0.238.16±0.158.10±0.018.30±0.188.20±0.17日增重ADG0.46±0.01a0.47±0.01a0.48±0.01ab0.51±0.02c0.50±0.02bc日采食量ADFI0.81±0.050.75±0.010.78±0.020.76±0.080.76±0.03料重比F/G1.67±0.131.58±0.011.66±0.071.52±0.151.53±0.04注：同行肩标小写字母不同表明差异显著(P＜0.05)。下表同。Note:withinthesamerowfollowedbydifferentsuperscripts,whichcontaindifferentlowercaselettermeansasignificantdifference(P﹤0.05).Itisthesametobelow.由表3-4可以看出：各处理组仔猪的初始体重和日均采食量均无明显差异（P＞0.05）。20%、30%发酵料组仔猪的日增重较抗生素组和微生态制剂组得到显著（P＜0.05）的提高，且20%发酵料组较10%发酵料组显著（P＜0.05）提高了6.25%；其余各处理组相比无明显差异（P＞0.05）。发酵料组仔猪的料重比较抗生素组有一定的降低，但无显著差异（P＞0.05）。3.2.2发酵全价料对断奶仔猪腹泻率和粗蛋白表观消化率的影响表3-5发酵全价料对断奶仔猪腹泻率和粗蛋白表观消化率的影响（%）Table3-5Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onthediarrhearateandtheproteindigestibilityinweanedpiglets(%)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF腹泻率Diarrhearate4.94±0.01c2.82±0.00b1.59±0.01a1.41±0.01a1.23±0.01a消化率CPdigestibility80.91±3.3881.85±1.0882.75±1.4984.54±2.2080.86±0.58由上表3-5可得知：在腹泻率上，微生态制剂组显著（P＜0.05）低于抗生素组，降低了42.91%；发酵料组均显著（P＜0.05）低于抗生素组和微生态制剂组，而发酵料组之间差异不明显（P＞0.05）。在粗蛋白消化率上，20%发酵料组最高，30%发酵料组最低，而各处理组相比无显著差异（P＞0.05）。18 河南农业大学2015届硕士学位论文3.2.3发酵全价料对断奶仔猪血清生化指标的影响3.2.3.1发酵全价料对断奶仔猪总蛋白、白蛋白和球蛋白的影响表3-6发酵全价料对断奶仔猪总蛋白、白蛋白和球蛋白的影响（g/L）Table3-6Effectsoffermentedcompletefeed（FCF）onthetotalprotein,albuminandglobulininweanedpiglets(g/L)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF总蛋白TP47.70±2.00a58.75±0.25b54.97±9.85ab53.70±2.61ab57.07±7.31ab白蛋白ALB27.10±2.2029.05±1.0525.60±3.0827.47±4.3027.63±3.15球蛋白GLO20.60±0.20a29.70±1.30b29.37±6.92b26.23±1.72ab29.43±5.04b白/球蛋白ALB/GLO1.32±0.12b0.98±0.08a0.89±0.12a1.06±0.23ab0.95±0.15a由表3-6看出：在总蛋白上，抗生素组最低，微生态制剂组最高，且抗生素组显著（P＜0.05）低于微生态制剂组，各发酵料组均高于抗生素组、低于微生态制剂组，但差异不显著（P＞0.05）。各处理组断奶仔猪的血清白蛋白无显著差异（P＞0.05）。在球蛋白上，微生态制剂组、10%和30%发酵料组均显著（P＜0.05）高于抗生素组；其它处理组相比无明显差异（P＞0.05）。在白蛋白/球蛋白上，微生态制剂组和10%、30%发酵料组均显著（P＜0.05）低于抗生素组；其余处理组之间无显著差异（P＞0.05）。3.2.3.2发酵全价料对断奶仔猪血清尿素氮和葡萄糖的影响表3-7发酵全价料对断奶仔猪血清尿素氮和葡萄糖的影响（mmol/L）Table3-7Effectsoffermentedcompletefeed（FCF）ontheserumureanitrogenandglucoseinweanedpiglets(mmol/L)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF尿素氮BUN3.93±0.31a5.09±0.35b3.62±0.64a3.37±0.89a4.00±0.41a葡萄糖GLU5.48±0.30ab4.97±0.33a5.05±0.71a5.58±0.29ab6.34±0.63b由表3-7可以看出：与抗生素组相比，发酵料组仔猪的血清尿素氮和血糖含量没有显著差异(P＞0.05）；而与微生态制剂组相比，发酵料组均显著（P＜0.05）降低了仔猪血清中尿素氮含量，30%发酵料组显著（P＜0.05）提高了血糖水平。3.2.3.3发酵全价料对断奶仔猪血清中谷丙、谷草转氨酶的影响发酵无抗全价料对断奶仔猪血清中谷丙、谷草转氨酶活性的影响见表3-8。由表可以看出：与抗生素组和微生态制剂组相比，发酵料组对仔猪的谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性以及谷草/谷丙转氨酶活性均无显著差异（P＞0.05）。19 河南农业大学2015届硕士学位论文表3-8发酵全价料对断奶仔猪血清中谷丙、谷草转氨酶的影响（IU/L）Table3-8Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onglutamic-pyruvictransaminaseandglutamicoxalacetictransaminaseinweanedpiglets(IU/L)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF谷丙转氨酶ALT76.50±6.5077.00±12.00108.33±31.0790.33±28.29100.00±35.16谷草转氨酶AST71.50±21.5050.65±7.3563.00±23.4361.67±47.9677.33±11.15谷草/谷丙AST/ALT0.96±0.360.68±0.200.61±0.280.64±0.450.83±0.283.2.3.4发酵全价料对断奶仔猪血脂和胆固醇的影响表3-9发酵全价料对断奶仔猪血脂和胆固醇的影响（mmol/L）Table3-9Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onlipidandcholesterolinweanedpiglets(mmol/L)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF甘油三酯TG1.47±0.080.53±0.200.48±0.060.71±0.070.62±0.19总胆固醇GH2.24±0.19ab1.99±0.33a2.23±0.27ab2.58±0.33b2.74±0.36b高密度胆固醇HDL1.11±0.09abc0.92±0.13a1.01±0.15ab1.25±0.22bc1.34±0.17c低密度胆固醇LDL0.97±0.13ab0.88±0.16a0.98±0.14ab1.07±0.04ab1.23±0.23b由表3-9可知：在甘油三酯上，抗生素组含量最高，10%发酵料组含量最低，但各处理组相比无明显差异（P＞0.05）。在总胆固醇和高密度胆固醇上，20%、30%发酵料组显著高于微生态制剂组（P＜0.05），其余各处理组之间无显著差异（P＞0.05）。在低密度胆固醇上，30%发酵料组比微生态制剂组显著（P＜0.05）提高了39.77%，其它处理组之间无显著差异（P＞0.05）。3.2.3.5发酵全价料对断奶仔猪血清免疫球蛋白的影响20 河南农业大学2015届硕士学位论文表3-10发酵全价料对断奶仔猪血清免疫球蛋白的影响（g/L）Table3-10Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onimmuneglobulininweanedpiglets(g/L)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCFIgA0.01±0.000.01±0.000.01±0.000.02±0.000.12±0.18IgG2.63±0.034.17±0.294.22±1.774.22±0.294.42±1.49IgM0.26±0.03a0.44±0.08b0.38±0.16ab0.28±0.05ab0.45±0.09b由3-10可以看出：各处理组仔猪的血清IgA和IgG含量没有显著差异（P＞0.05），但发酵料组均有一定的提高。在IgM含量上，微生态制剂组比抗生素组显著（P＜0.05）提高了40.91%；30%发酵料组明显（P＜0.05）高于抗生素组，其它处理组相比没有明显差异（P＞0.05）。3.3讨论3.3.1湿态发酵全价料对断奶仔猪生产性能的影响本试验发酵料所用的菌液主要是由乳酸菌和酵母菌组成的复合益生菌。无抗全价料在发酵后会产生一定量的活菌，酵母菌等好氧菌在发酵过程中会消耗大量氧气，为肠道提供厌氧环境而促进乳酸菌的大量繁殖，促使乳酸等有机酸大量产生，既可散发出酸香味，改善饲料的适口性，还能降低肠道PH，提高动物对饲料的消化利用率[50]。在本试验中，与抗生素组和微生态制剂组相比，发酵料组对断奶仔猪的日采食量和料重比没有显著影响，而20%和30%发酵料组则分别显著提高日增重10.87%、8.70%。这可能是由于同一批所做的发酵料有些储存时间有点久而导致饲料的PH值发生变化，此外还可能是发酵过后产生某些挥发性的脂肪酸影响了饲料的适口性，具体原因尚需深入探讨。综合相比得出20%无抗发酵饲料组效果较好。说明无抗发酵饲料的添加存在一个最适宜的水平和范围的问题，而不是添加量越多效果就越好。胡新旭等[51]的试验分析表明可能是由于过多的微生物活菌进入动物肠道后会再额外消耗部分营养物质，进而影响动物本身（宿主）对营养物质的吸收和利用，从而影响了动物的生长发育。魏金涛等（2009）的试验研究表明将复合型基础日粮进行发酵可促使仔猪的日均增重增加，料重比和腹泻率降低；刘瑞丽等[52]试验发现，在日粮中加入一定比例的非常规发酵饲料，育肥猪的生长性能有了相应的改善。吕永飞[53]的试验却出现相反的结果，他将微生态制剂进行发酵后再喂猪，发现试验组育肥猪的日增重提高了14.92%，但差异并不显著。出现这种差异有可能是因为发酵的环境条件、选用的菌种以及菌种组合和接种量或加工程序不同，导致发酵后的饲料品质存在差异，从而影响了饲喂效果。21 河南农业大学2015届硕士学位论文3.3.2发酵全价料对断奶仔猪腹泻率和粗蛋白消化率的影响仔猪在出生3周后，由于其胃肠道发育还不够完全和成熟，消化功能还不健全；且其胃肠腔较窄，胃底腺尚不发达，机体特有的运动机能相对还比较弱，并且小肠绒毛长度、绒毛表面积以及淋巴细胞等，这些与营养物质的摄取与吸收密切相关的肠道组织还处在生长发育期，仔猪突然性断奶，小肠黏膜更易受到损伤，从而降低了小肠对营养物质的消化吸收[54]。本试验发现，在仔猪日粮中添加微生态制剂和无抗发酵饲料均可有效降低腹泻率，且发酵饲料的效果要优于微生态制剂；在消化率上，虽效果不明显，但有一定的提高。究其缘由可能为：其一，微生态制剂是以芽孢杆菌为主的复合益生菌，在迁移到动物肠道可生成一些挥发性脂肪酸,致使其PH变小，为厌氧菌提供有利的酸性环境；同时其在代谢过程中，还会产生一些抗菌物质，可改善肠道菌群的平衡。其二，发酵液所含的乳酸菌在发酵过程中会生成多种消化酶可在一定程度上把饲料中具有复杂结构的大分子物质分解成易消化的营养物质（如有机酸、小分子肽、游离氨基酸等），改善了饲料的适口性[55]，提高了饲料转化率和动物的消化率。其三，本试验基础日粮中的大豆、豆粕和乳清粉等蛋白原料经过发酵后可以降低原料中的抗营养因子，产生一些特殊功效的小肽、酶以及乳酸等活性成分，提高饲料的营养价值和利用率。郑泽敦等[56]发现在基础日粮中添加10%的发酵乳清粉后，腹泻率分别比对照组、试验Ⅰ组降低了90.65%、76.79%，粗蛋白消化率提高了9.02%、3.23%。吕锋（2010）的试验结果表明，给断奶仔猪饲喂混菌发酵的全价[57]料后，可以显著降低腹泻率77.78%。周小辉等试验研究表明全价料经过发酵后可产生许多具有活性成分的益生菌和其代谢产物，从而调节并维持了胃肠道菌群的平衡状态，提高了消化酶的活性，进而增强了动物对饲料养分的消化吸收力度，具有降低断奶仔猪腹泻率和改善其肠道健康的功效。以上试验研究表明发酵饲料可以在一定水平上提高动物的消化率和降低动物的腹泻率。3.3.3发酵全价料对断奶仔猪血清生化指标的影响血清总蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成。血清白蛋白具有解毒、维护血液中的酸碱平衡等作用，它能够参与动物体内的氨基酸代谢，使机体有效利用体内的蛋白质，加强蛋白质的沉积，增强动物的抗病力。血清球蛋白能够参与机体的体液免疫，白蛋白与球蛋白比值的高低反应了动物对疾病抵抗力的强弱，比值小说明球蛋白的含量高，机体的免疫功能增强。总之，血清总蛋白含量的高低取决于动物机体蛋白质的代谢功能的强弱，它能反应动物的营养状况和蛋白质在体内的沉积。当血清总蛋白含量升高时，机体组织蛋白的合成功能就会加强，从而促进动物的生长。本试验发现，微生态制剂能显著提高断奶仔猪的总蛋白和球蛋白的含量，并促使白/球蛋白比值变小；无抗发酵饲料对断奶仔猪的总蛋白和白蛋白有一定的提高，但差异不明显；10%和30%发酵饲料组可在一定程度上显著提高仔猪血清球蛋白和降低白/球蛋白。说22 河南农业大学2015届硕士学位论文明微生态制剂和发酵饲料能改善仔猪机体的蛋白质吸收和代谢状况，提高其抗病力。杨玉芬等[58]研究报道，在仔猪日粮中加入一定水平的发酵豆粕可以明显增加其血清总蛋白含量，提高动物的生产性能，与本试验结果相似。在生理正常值范围内，动物血糖含量的高低与肠道对营养物质消化吸收作用的强弱呈正相关。因为血液中的葡萄糖一般是通过肠道吸收和肝糖原分解获得的，而采血通常是在动物空腹的状态下进行的，说明血液所含的葡萄糖主要来自消化道的吸收，所以，提高动物的消化率可以间接提高血清中的葡萄糖含量。血糖是反应动物生命活力的一个指标，在一定范围内提高血糖含量可以增强动物的免疫力和抗应激能力。从本试验结果可以看出，发酵料组大多对断奶仔猪的血糖含量没有显著影响，但随着发酵饲料添加比例的增加，血糖含量会相应的升高，这是因为微生物在发酵过程中会产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及纤维素酶等消化酶，可将饲料中的蛋白质、多糖、脂肪和部分纤维素等降解成易消化吸收的有机酸、多肽、氨基酸和维生素等，促进了营养物质之间的代谢，进而提高血糖水平。表明发酵饲料可以提高动物对营养物质的消化率和增强其抗应激能力。血清中的尿素氮，是动物机体蛋白质和氨基酸代谢的主要终产物，也是衡量动物机体氨基酸需要量的重要指标。饲料中蛋白质水平、氨基酸组成与平衡状态以及动物的肝功能等会影响机体尿素的合成，且尿素的浓度会随着体内氮的沉积率、蛋白质或氨基酸利用率的升高而减少。所以，降低较血清中的尿素氮含量，能够维持氨基酸平衡和提高机体蛋白质的合成率。刘海燕等[59]在研究发酵豆粕对断奶仔猪血液指标影响的试验中，发现给仔猪饲喂发酵豆粕后，其血清尿素氮含量会显著减少。王之盛等研究[60]报道，在仔猪日粮中添加酶解豆粕可以使血清尿素氮极显著降低48.78%。该研究发现，微生态制剂会明显增加仔猪血清尿素氮含量，而发酵料组显著低于微生态制剂组，相对低于抗生素组，但差异均不显著。说明，在日粮中添加适量的发酵饲料可以在某种程度上降低仔猪的血清尿素氮含量，维持机体氨基酸平衡状态。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是动物机体转氨酶中活性较高并可衡量蛋白质合成和分解代谢状况的两种关键酶，其活性的高低反映了氨基酸代谢的强弱和肝脏所能承受的负荷程度。正常情况下，ALT和AST的活性以肝脏和心肌细胞中较高，血清中较低，但当组织细胞发生病变或受损时，大量的ALT和AST逸入血液，就会使其活性升高。有研究表明适当降低血液中ALT和AST的活性有利于促进氨基酸代谢、提高动物的生长速度。而本试验结果表明，各处理组断奶仔猪血清中ALT和AST的活性没有显著差异，说明在日粮中添加发酵饲料不会影响仔猪肝脏的正常功能。甘油三酯是动物机体中浓度较高的脂类物质，其大多数组织都能将甘油三酯的分解产物转变成能量物质，此外甘油三酯还能在肝脏、脂肪等组织中合成，并存储于脂肪组织中。所以，甘油三酯是动物机体内主要的能量来源。吴强等[61]报道指出，血清中甘油三酯的含量在一定程度上能反映动物机体合成脂肪的强度，当体内氨基酸的结构受到影响，破坏了23 河南农业大学2015届硕士学位论文平衡状态时，那些相对过量或不能合成蛋白质的氨基酸便会合成甘油三酯。试验研究发现，各处理组仔猪的甘油三酯含量无显著差异。说明发酵饲料不会影响仔猪体内的氨基酸结构和平衡状态。血清中总胆固醇的含量可衡量动物机体的脂类代谢功能是否健全，其通常只有和脂蛋白紧密结合后才能被转运到体内的各组织中。LDL可协助机体的组织运载相应的胆固醇，促使细胞摄取的胆固醇含量升高，而HDL则将外周组织的胆固醇运回至肝脏完成代谢。Derek等[62]研究报道嗜酸乳杆菌能够使动物体内的胆固醇含量降低。该试验结果看出，在总胆固醇和高密度胆固醇上，发酵料组与抗生素组没有明显差异，20%、30%发酵料组显著高于微生态制剂组；在低密度胆固醇上，除30%发酵料组显著高于微生态制剂组外，其它处理组间无明显差异。这可能跟猪只的体况有关，具体原因还需进一步研究。当机体受到病原体感染或侵害时，血清中IgA、IgG和IgM等免疫球蛋白作为抗体可与外来侵入者特异性结合，发挥抵抗细菌、病毒等免疫功能，保护机体免受损害。IgA能激活补体发挥黏膜免疫效应；IgG具有免疫活性且含量较高、能持续较长时间，是机体中一种重要的免疫球蛋白。IgM属于动物机体在初次接触病原微生物发挥体液免疫效应时较早产生的抗体。徐栋等[63]试验结果表明，提高仔猪血清中免疫球蛋白含量，可以有效增强仔猪的抗病力，缓解腹泻现象。本试验结果表明，各组仔猪的IgA、IgG的含量差异不显著，但发酵饲料组均有不同程度地提高，20%和30%发酵饲料组的IgA含量比抗生素组分别提高了1倍、11倍，IgG含量提高了60.46%、68.06%；而微生态制剂组和30%发酵饲料组仔猪的IgM含量分别比抗生素组显著提高了69.23%、73.08%。本试验会出现上述结果可能是由于发酵料所具有的益生菌在仔猪胃肠道内定植后可充当免疫激活剂，刺激相应的免疫器官、组织和细胞的生长，在一定程度上提高了巨噬细胞的活性，增强其自身免疫力，同时，饲料在发酵过程中可产生少量小肽类物质，促进了肠道的体液免疫和细胞免疫，从而提高了机体的抗病力[64]。说明，发酵饲料在一定水平上可提高仔猪的免疫球蛋白含量，这也对应了发酵饲料具有提高仔猪的日增重、降低腹泻率的功效。3.4小结（1）与抗生素组和微生态制剂组相比，20%、30%发酵料组可显著提高仔猪ADG，对F/G有所降低。（2）与抗生素组和微生态制剂组相比，发酵全价料组可显著降低仔猪腹泻率。（3）与抗生素组相比，10%、30%发酵料组显著提高仔猪血清球蛋白水平，30%发酵料组显著提高IgM含量。（4）与微生态制剂组相比，日粮中添加适量的发酵全价料能降低仔猪血清中尿素氮含量和提高血糖浓度。（5）与抗生素组相比，日粮中添加10%发酵料对仔猪血清中谷草转氨酶活性和甘油三酯含量有一定的降低。24 河南农业大学2015届硕士学位论文4试验二湿态发酵全价料对断奶仔猪肠道发育的影响4.1材料与方法4.1.1试验材料发酵所用菌液由山东农科院微生物研究所提供，主要成分为嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、酿酒酵母菌等，活菌数≥2.0×108CFU/mL。枯草与地衣芽孢杆菌的复合型微生态制剂由山东农科院微生物研究所提供，活性成分为200～2000×108/g。硫酸粘杆菌素和恩拉霉素等抗生素由河南碧云天饲料有限公司提供。4.1.2试验动物选择体况良好、体重为（8.20±0.16）kg的“杜洛克×长白×大白”断奶仔猪160头，于2014年11月12日至12月14日在河南省禹州市鸿畅镇发群种猪场进行试验，其中预试期5d，正式期28d。4.1.3试验设计及日粮处理试验选取体况良好、体重为（8.20±0.16）kg的杜×长×大型仔猪160头，采用单因子随机区组设计随机分配于5种日粮（每组4个重复，每个重复8头猪）中：1）基础日粮＋20mg硫酸粘杆菌素+12mg恩拉霉素（抗生素组）；2）基础日粮＋0.1%枯草与地衣芽孢杆菌的复合微生态制剂（微生态制剂组）；3）10%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮（10%发酵料组）；4）20%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮（20%发酵料组）；5）30%湿态发酵全价料替代部分无抗基础日粮（30%发酵料组）。抗生素为在每千克预混料中添加20mg硫酸粘杆菌素+12mg恩拉霉素。基础日粮参照美国NRC2012年猪营养指南推荐水平配制而成。饲粮组成及营养水平见表4-1。25 河南农业大学2015届硕士学位论文表4-1试验基础日粮组成和营养水平（风干基础）Table4-1Ingredientcompositionandnutrientlevelofbasaldiet（air-drybasis）原料Ingredient含量Content，%营养水平Nutrientlevel2)含量Content玉米Corn48粗蛋白CP%20.3全脂大豆Full-fatsoybean14消化能DEMJ/kg14.43发酵豆粕Fermentedsoybeanmeal8钙Ca0.82乳清粉Wheypowder11总磷TP0.63鱼粉Fishmeal4有效磷AP0.41大豆浓缩蛋白Soyproteinconcentrate3赖氨酸Lys1.45乳脂粉Fatpowder3蛋氨酸Met0.44豆粕Soybeanmeal3蛋+胱氨酸Met+Cys0.76大豆油Soybeanoil2苏氨酸Thr0.94磷酸氢钙CaHPO41色氨酸Trp0.26石粉Limestone0.5乳猪预混料（2.5%）Premix1)2.5合计Total1001)预混料为每千克饲粮提供Thepremixprovidedthefollowingperkgofdiets:VC257mg,VE50mg,猪用多维Vitaminpremixforpigs450mg,Fe150mg,Zn180mg,Cu50mg,1.0%酵母铬1.0%chromiumyeast75mg,抗氧化剂antioxidant94mg,防霉剂anti-mold219mg,乳酸宝AcidLac5000mg,氯化胆碱choline375mg,叶酸folicacid0.1mg,烟酸niacin75mg,生物素biotin0.375mg,精盐refinedsalt2875mg。2)粗蛋白、钙、总磷为测定值，其它为计算值。CP,CaandTPwereanalyzedvalues,whiletheotherswerecalculated.4.1.4饲养管理试验仔猪（23±2）d断奶，在断奶当天先赶走母猪，仔猪留原圈饲养一周后转入保育舍。然后采用分栏饲养，一个重复一栏，仔猪自由采食和饮水，每天分别在06:00、09:30、13:00、16:30、20:00进行定点饲喂，少喂勤添，每天清扫被溢出料槽的料和剩余料并称好重，遵从所在猪场正常免疫程序开展免疫，保持良好的通风与换气，保证平均舍温在（24±2）℃，湿度在60%～75%。4.1.5样品采集4.1.5.1粪样的采集在试验最后一天时，以圈舍为单位，分别用10mL灭菌离心管采集新鲜无污染的仔猪（每个圈舍选3头仔猪）粪样混匀后尽快放入4℃冰箱保存待测微生物活菌数。4.1.5.2肠道内容物、肠道组织与黏膜的提取和处理方法26 河南农业大学2015届硕士学位论文1）在试验结束当天，每个处理选取2头仔猪，处死后迅速抛开腹腔，取出胃肠道，置于冰上，然后用无菌棉线结扎消化道各段，取大肠各肠段（盲肠、结肠、直肠）前段食糜，混匀后分装于2mL冷冻管中-20℃保存，用作肠道菌群的分析。2)随后分别截取小肠各段的中间部位组织3cm，经4℃生理盐水轻轻冲净后浸泡到10倍体积的10%的中性福尔马林溶液中固定，待用于分析仔猪肠道黏膜结构。3)分别采集仔猪小肠各段的前、后段，纵向剖开，用生理盐水冲净后刮取肠黏膜并分装于2mL冷冻管中，-80℃保存，待测黏膜中二糖酶活。4.1.6指标测定4.1.6.1粪样中微生物菌群活菌数的测定粪样的稀释：称取0.5g粪样于无菌试管中，用4.5mL灭菌的生理盐水稀释混匀即为10-1稀释液，然后接着依次从10-2稀释到10-7。（1）大肠杆菌：移取10-4～10-6粪样稀释液0.1mL接种于EMB培养基上，每个稀释度3个重复，在37℃培养箱中培养24h进行菌落计数，记录那些呈紫黑色且带有金属光泽的总菌群数。EMB培养基制作的主要成分（1L，PH为7.2±0.4）：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，琼脂14g，伊红0.4g，美蓝0.065g，蒸馏水1000mL。（2）乳酸菌：移取10-5～10-7稀释液0.1mL接种于MRS培养基上，每个稀释度3个重复，在37℃培养箱中培养48h进行计数，记录乳白色、偏黄、表面光滑、凸起、边缘整齐且不透明的菌落的数量。MRS培养基制作的主要成分（1L，PH为6.2～6.6）：胰蛋白胨15g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，柠檬酸钠2g，吐温-801mL，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。（3）酵母菌：分别取10-5～10-7稀释液0.1mL接种于YPD培养基上，每个稀释度3个重复，30℃厌氧培养48h进行计数。YPD培养基制作的主要成分（1L）：胰蛋白胨10g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。菌群计数值需转换成每克粪样所含的菌落数（cfu/g），并以10的对数（lg）表示结果。4.1.6.2小肠黏膜形态结构的测定将固定好的十二指肠、空肠、回肠中段组织样品经一系列处理（修块、冲水、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片）后再通过H&E染色、中性树胶封片。而后在光学显微镜下观察染好色的切片的小肠黏膜结构。显微镜照相和测量：从每个处理组仔猪的对应肠段的切片中选取5张（每张选5个典型视野即绒毛完整且伸展良好），用LEICADM2000设备的LeicaQwin，参照Touchette等[65]的方法测量每张切片中5根最长的绒毛高度和最深的隐窝深度，算出绒毛高度(VH)与隐窝深度(CD)的比值，并根据陈付菊等[66]的试验方法测量这5根较长绒毛中每根绒毛上每100个柱状上皮细胞间上皮内的淋巴细胞数量。各指标取平均数作为测定数据。①绒毛高度（VH）：从绒毛顶段至其与肠腺连接处的垂直距离；②隐窝深度（CD）：从绒毛-隐窝连接处至隐窝基底部的垂直距离。27 河南农业大学2015届硕士学位论文4.1.6.3肠道黏膜二糖酶活的测定小肠黏膜液的提取：将各肠段黏膜样品取出解冻后称量0.5g左右，加入4.5mL的4℃生理盐水，冰浴中匀浆20s，4℃放置过夜，然后以3000r/min的转速离心15min，将所得上清液于-20℃保存待测二糖酶活性。二糖酶活力单位：在37℃PH6.0的条件下，每毫克蛋白组织每分钟水解1nmol的二糖定义为1个酶活力单位。采用南京建成生物工程研究所的二糖酶测试剂盒测定肠道黏膜中的蔗糖酶、麦芽糖酶和乳糖酶活性。按其使用书说明方法，操作步骤如下表：表4-2小肠黏膜二糖酶活的测定Table4-2Determineintestinalmucosadisaccharidaseactivity样品空白管标准管测定管对照管双蒸水（uL）10---5.55mmol/L葡萄糖液（uL）-10--待测样本（uL）--10-底物（uL）20202020混匀，37℃水浴20min终止剂（uL）10101010显色剂（mL）1111样本（uL）---10随后，37℃水浴15min，用0.5cm光径的比色皿通过分光光度计于505nm处进行平行比色测定各管中吸光度OD值。二糖酶活力（U/mgprot）=(测定OD-对照OD)÷（标准OD一空白OD）×a*÷t÷b*÷n*×1000。注：a为标准样品的浓度(5.55mmol/L)；b为待测样本的蛋白浓度（mgprot/mL）；t为反应时间20min；n为系数，乳糖和蔗糖为1，麦芽糖则为2。通常采用考马斯亮蓝法来测样品中总蛋白的含量。本试验仔猪肠道黏膜液的总蛋白的浓度是运用南京建成的考马斯亮蓝蛋白试剂盒进行测定的，其原理为：样品蛋白分子中所含的-NH3+基团，在遇到考马斯亮蓝染料上的阴离子并与其结合时，该显色剂（棕红色）在移入蛋白标准液或黏膜上清液后就会发生反应，促使溶液呈现蓝色，从而测定出吸光度即可算出黏膜液中的总蛋白含量。蛋白含量(gprot/L)=(测定OD一对照OD)/（标准OD-空白OD）×a*×n*。注：a为黏膜液的标准蛋白含量（0.563gprot/L)；n为样本测定前所稀释的倍数（10）。4.1.6.4肠道菌群的分析由于动物消化道前部的微生物易受到饮水、饲料以及消化液的影响，其细菌种类和数28 河南农业大学2015届硕士学位论文量时常处于波动状态，而肠道后段微生物因不易受到外界因素的干扰则处于相对稳定状态，且大肠肠道内环境多呈中性或微碱性，可促进细菌的生长繁殖，故其菌群数量要远多于小肠。本试验主要选取仔猪大肠内容物来进行肠道菌群的分析。将仔猪盲肠和结肠内容物以及直肠粪样混匀用ZRSoilMicrobeDNAMiniPrep™Kit（ZymoResearch）提取肠道微生物总DNA。采用细菌通用引物对细菌16SrDNA的V6-V8区片段进行PCR扩增，将PCR扩增产物于变性梯度凝胶电泳分离，电泳结束后AgNO3染色，显色定影后，用凝胶成像扫描系统拍照。切下不同位置的条带，用于DNA回收和测序，将所得序列与数据库中的已知序列进行比对。使用quantityone软件对PCR-DGGE电泳图谱进行条带相似性聚类分析和条带多样性分析。肠道内容物细菌总DNA的提取：（1）分别称取大肠各肠段食糜0.25g至ZRBashingBead™LysisTube中，移入750µL裂解液，并振荡5min混匀后以12000g的转速离心1min；（2）吸取400uL上清液至Zymo-Spin™IVSpinFilter，套上底管，以7000g离心1min后加入1200uL基因组裂解缓冲液并混匀；（3）吸取800uL混合液到Zymo-Spin™IICColumn，套上新的底管，以10000g离心1min，倒掉废液；吸取剩余的混合液，重复Step2；（4）然后加入200uLDNA前期冲洗缓冲液套上底管，以10000g的转速离心1min，倒去多余的液体后再加入500uLDNA冲洗缓冲液离心1min，倒掉废液后接着套上底管同样离心2min；（5）将Zymo-Spin™IICColumn至一新的1.5mL离心管中，加100uLDNA洗脱缓冲液离心1min，将收集的液体转移至Zymo-Spin™IV-HRCSpinFilter，套上新的1.5mL离心管，以8000g离心1min，将收集的溶液-20℃保存备用。细菌总DNA的检测：用1%琼脂糖凝胶电泳检测凝胶成像情况，并用核酸定量仪检测样品DNA的浓度与纯度，测得部分处理组仔猪盲肠内容物中DNA纯度不合格只好舍弃，而各处理组仔猪结肠和直肠食糜中DNA的OD260/280值均在1.8-2.0之间可用于后续试验，。细菌总DNA的扩增：采用细菌通用引物对细菌的16SrDNA基因的V6-V8区片段进行PCR扩增[67]。引物[68]（由上海生工生物工程有限公司合成）的设计及PCR的扩增如下：29 河南农业大学2015届硕士学位论文表4-3PCR-DGGE所用引物Table4-3PrimersappliedtoPCR-DGGEanalysis引物Primer序列5′-3′Sequence5′-3′F968-GC*5'-GC-clamp-AACGCGAAGAACCTTAC-3'R13785'-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3'F9845'-AACGCGAAGAACCTTAC-3'R13785'-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3'GC-clamp(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’).表4-4PCR反应体系（优化）Table4-4PCRreactionsystem(optimized)deionizedwater10uL2×KODFxBuffer25uLdNTPs(10mM)10uLF968(10uM)1.5uLR1378(10uM)1.5uLKODFx（1U/uL）1.0uLDNAtemplate1.0uL表4-5PCR扩增条件Table4-5PCRamplificationconditionsInitialdenaturation94℃,2min98℃（denaturation）,10sec35cycles58℃（anneal）,15sec68℃（extension）,30secPCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段约400bp。DGGE的试验分析：参照Muyzer[69]的试验方法，采用Dcode-DGGE系统(Bio-Rad)对PCR产物进行检测分析。电泳条件：PAGE（聚丙烯酰胺）为6%，（尿素）凝胶变性梯度为45%-60%，电泳缓冲液为1×TAE，电泳温度60℃，电压100V，电泳时间20h。电泳结束后，快速银染后拍照。DGGE电泳的条带分析：采用凝胶定量软件QuantityOne对DGGE图谱进行UPGAMA相似性聚类分析和香农威尔多样性指数（Shannon-WienerIndex）分析。相似性系数Ct=2j/(Nm+Nn)，t为条带数量，Nm、Nn分别为位于m、n泳道的条带数；j为共有的条带数。30 河南农业大学2015届硕士学位论文香农威尔指数H=∑Pi*(-logPi)，pi为第i条带的灰度占该泳道总灰度的比值。DGGE的条带回收与测序：预先在1.5mL离心管中加入500uLSDW，随后切下标记的共性和特异性条带放入其中，上下颠倒混匀进行漂洗，在常温下以10000rpm的转速离心1min，倒掉上清液后接着重复一次；再加入30uLDGGETrisBuffer，4℃放置过夜，以12000rpm的转速离心5min；取上清作进一步的PCR扩增试验。表4-6DGGE回收条带的PCR反应体系Table4-6PCRreactionsystemusedforDGGErecyclestripedeionizedwater7.0uL2×KODFxBuffer25.0uLdNTPs(10mM)10.0uLF968(10uM)1.5uLR1378(10uM)1.5uLKODFx（1U/uL）1.0uLDGGEsupernate4.0uL表4-7DGGE回收条带的PCR扩增反应条件Table4-7PCRamplificationconditionsusedforDGGErecyclestripeInitialdenaturation94℃,2min98℃（denaturation）,10sec30cycles58℃（anneal）,15sec68℃（extension）,30sec切胶回收筛选后寄送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。测定结果用Blast在Geenbank16sribosomalRNAsequences（BacteriaandArchaea）数据库中进行比对分析。4.1.6.5数据统计与分析试验数据以重复为单位，采用Spss20.0统计软件中的ANOVA（单因素方差分析）和Duncan（多重比较）对各项指标进行分析，评定P<0.05为显著水平，结果以“平均值+标准差”表示。4.2结果与分析4.2.1发酵全价料对断奶仔猪粪样中微生物活菌数的影响由表4-8可以看出：在乳酸菌菌群活菌数上，抗生素组、微生态制剂组与10%发酵料组之间差异不显著（P＞0.05），20%、30%发酵料组较此3个组显著（P＜0.05）增加；20%和30%发酵料组相比没有显著差异（P＞0.05）。在大肠杆菌菌群活菌数上，抗生素组和31 河南农业大学2015届硕士学位论文微生态制剂组之间差异不显著（P＞0.05）；发酵料组显著（P＜0.05）低于抗生素组和微生态制剂组，但发酵料组之间无显著差异（P＞0.05）。在酵母菌菌群活菌数上，各处理组之间差异不显著（P＞0.05）；发酵料组有一定的增加。表4-8发酵全价料对断奶仔猪粪样中微生物活菌数的影响(cfu/g)Table4-8Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onfaecalmicrobialnumberinweanedpiglets(cfu/g)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF乳酸菌活菌数Lacticacidbacteria6.62±0.01a6.79±0.10a6.94±0.26a8.34±0.45b8.39±0.24b大肠杆菌活菌数E.coli7.48±0.17b7.46±0.08b6.36±0.24a5.40±0.78a5.65±0.91a酵母菌活菌数Yeast6.00±0.186.23±0.076.33±0.307.05±0.467.02±1.054.2.2发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜形态结构的影响4.2.2.1发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜绒毛高度的影响表4-9发酵无抗全价料对断奶仔猪小肠黏膜绒毛高度的影响（um）Table4-9Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosavilliheight(VH)inweanedpiglets(um)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠绒毛高度VHofduodenum557.76±19.82ab584.90±24.32b720.01±29.76c722.78±52.71c509.95±48.31a空肠绒毛高度VHofjejunum357.28±18.70a318.97±13.50a468.11±45.89bc519.16±32.47c443.89±24.89b回肠绒毛高度VHofileum341.14±27.86a368.23±39.06a394.06±37.29ab510.95±34.29c456.73±54.17bc由表4-9可以看出：在十二指肠VH上，微生态制剂组比抗生素组提高了4.87%，但无显著差异（P＞0.05）；10%和20%发酵料组显著（P＜0.05）高于抗生素组、微生态制剂组和30%发酵料组；30%发酵料组显著（P＜0.05）低于微生态制剂组，而与抗生素组差异不显著（P＞0.05）。在空肠VH上，抗生素组和微生态制剂组之间没有显著差异（P＞0.05）；32 河南农业大学2015届硕士学位论文发酵料组均显著（P＜0.05）高于抗生素组和微生态制剂组；10%发酵料组与20%、30%发酵料组相比无显著差异（P＞0.05）；20%发酵料组比30%发酵料组显著（P＜0.05）提高了16.96%。在回肠VH上，20%和30%发酵料组均显著（P＜0.05）高于抗生素组和微生态制剂组；且20%发酵料组显著（P＜0.05）高于10%发酵料组，其余处理组相比无显著差异（P＞0.05）。下图为仔猪的部分小肠黏膜形态。33 河南农业大学2015届硕士学位论文图4-1仔猪的十二指肠和部分空肠黏膜形态结构Fig.4-1Morphologicalstructureofduodenumandpartjejunummucosainpiglets4.2.2.2发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜隐窝深度的影响表4-10发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜隐窝深度的影响（um）Table4-10Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosacryptdepth(CD)inweanedpiglets(um)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠隐窝深度CDofduodenum418.75±72.95c425.95±64.99c356.17±46.19ab328.84±45.28ab311.15±18.33a空肠隐窝深度CDofjejunum310.85±6.79b314.54±26.04b290.18±34.82ab278.26±46.78ab250.10±27.39a回肠隐窝深度CDofileum396.31±41.10b351.66±39.44ab357.90±68.03ab269.92±53.79a282.73±20.22a由表4-10知：在十二指肠CD上，抗生素和微生态制剂组相比没有显著差异（P＞0.05）；发酵料组均显著（P＜0.05）低于前2个组；但发酵料组之间无显著差异（P＞0.05）。在空肠CD上，抗生素和微生态制剂组之间差异不显著（P＞0.05）；30%发酵料组分别比抗生素和微生态制剂组显著（P＜0.05）降低了19.54%、20.49%；其它处理组相比没有显著差异（P＞0.05）。在回肠CD上，微生态制剂组比抗生素组降低了11.27%（P＞0.05）；且20%、30%发酵料组均显著（P＜0.05）低于抗生素组，其余处理组相比差异不显著（P＞0.05）。4.2.2.3发酵无抗全价料对断奶仔猪小肠黏膜绒毛高度与隐窝深度比值（VH/CD）的影响由表4-11可以看出：在十二指肠绒毛VH/CD上，抗生素和微生态制剂组相比没有显著差异（P＞0.05）；10%、20%发酵料组显著（P＜0.05）高于抗生素组和微生态制剂组，34 河南农业大学2015届硕士学位论文其余各处理组之间均无显著差异（P＞0.05）。在空肠VH/CD上，与抗生素组和微生态制剂组相比，发酵料组均显著（P＜0.05）增加；但各发酵料组之间没有显著差异（P＞0.05）。在回肠VH/CD上，20%发酵料组显著（P＜0.05）高于抗生素组、微生态制剂组和10%发酵料组，比30%发酵料组提高了21.12%（P＞0.05）；30%发酵料组显著（P＜0.05）高于抗生素组和微生态制剂组。表4-11发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜绒毛高度/隐窝深度比值的影响Table4-11Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosavilliheight/cryptdepth(VH/CD)inweanedpiglets组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠绒高/隐深VH/CDofduodenum1.35±0.19a1.40±0.24a2.04±0.24b2.24±0.45b1.70±0.32ab空肠绒高/隐深VH/CDofjejunum1.15±0.06a1.02±0.11a1.62±0.14b1.90±0.35b1.79±0.28b回肠绒高/隐深VH/CDofileum0.87±0.15a1.06±0.24a1.13±0.24ab1.95±0.47c1.61±0.20bc4.2.2.4发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜上皮内淋巴细胞数量的影响由表4-12可以看出：在十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数上，20%发酵料组比抗生素组、微生态制剂组和10%发酵料组分别显著（P＜0.05）提高了63.04%、55.84%、63.04%，其余各处理组之间差异不显著（P＞0.05）。在空肠和回肠黏膜上皮内淋巴细胞数上，发酵料组、微生态制剂组与抗生素组相比虽有一定的增加，但各组之间均差异不显著（P＞0.05）。表4-12发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜上皮内淋巴细胞数量的影响（个数）Table4-12Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosaintraepitheliallymPHocytesinweanedpiglets(number)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠淋巴细胞数IELsnumberofduodenum21.67±3.06a22.67±3.21a21.67±5.03a35.33±5.03b28.67±7.64ab空肠淋巴细胞数IELsnumberofjejunum15.00±1.0016.33±2.0818.00±2.0017.00±2.0017.67±4.04回肠淋巴细胞数IELsnumberofileum16.00±3.0020.00±5.5717.00±4.0019.33±2.5221.33±4.5135 河南农业大学2015届硕士学位论文4.2.3发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜二糖酶活的影响4.2.3.1发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜麦芽糖酶活的影响表4-13发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜麦芽糖酶活的影响（U/mgprot）Table4-13Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosamaltaseactivityinweanedpiglets(U/mgprot)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠麦芽糖酶活Maltaseinduodenum35.53±3.25a38.18±1.02ab39.53±0.72b40.49±0.28b39.97±0.44b空肠麦芽糖酶活Maltaseinjejunum34.11±2.7635.18±1.4036.42±0.2534.57±2.3734.72±2.08回肠麦芽糖酶活Maltaseinileum17.92±0.2518.07±0.8317.89±0.0919.36±1.2418.14±0.96由表4-13可以看出：各处理组断奶仔猪的空肠和回肠黏膜麦芽糖酶活性没有显著差异（P＞0.05）。在十二指肠黏膜麦芽糖酶活上，抗生素组活性最低，20%发酵料组活性最高，且抗生素组和微生态制剂组之间无显著差异（P＞0.05）；发酵料组显著（P＜0.05）高于此2个组，各发酵料组之间及其与微生态制剂组相比，均无显著差异（P＞0.05）。4.2.3.2发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜蔗糖酶活的影响由表4-14可知：各处理组断奶仔猪的十二指肠和回肠黏膜蔗糖酶活性没有显著差异（P＞0.05）。在空肠黏膜蔗糖酶活上，微生态制剂组和各发酵料组显著（P＜0.05）高于抗生素组；其它各处理组相比没有显著差异（P＞0.05）。表4-14发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜蔗糖酶活的影响（U/mgprot）Table4-14Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosasucraseactivityinweanedpiglets(U/mgprot)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠蔗糖酶活Sucraseinduodenum1.45±0.091.38±0.021.46±0.031.43±0.111.42±0.12空肠蔗糖酶活Sucraseinjejunum3.53±0.18a3.76±0.08b3.80±0.02b3.83±0.03b3.80±0.05b回肠蔗糖酶活Sucraseinileum2.73±0.212.92±0.032.96±0.032.93±0.142.89±0.1236 河南农业大学2015届硕士学位论文4.2.3.3发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜乳糖酶活的影响表4-15发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜乳糖酶活的影响（U/mgprot）Table4-15Effectsoffermentedcompletefeed(FCF)onintestinalmucosalactaseactivityinweanedpiglets(U/mgprot)组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF十二指肠乳糖酶活Lactaseinduodenum3.29±0.073.08±0.313.34±0.153.34±0.213.14±0.19空肠乳糖酶活Lactaseinjejunum2.43±0.12a2.34±0.10a2.40±0.09a2.43±0.02a2.65±0.02b回肠乳糖酶活Lactaseinileum1.54±0.011.54±0.051.48±0.131.60±0.051.51±0.06由表4-15可以看出：各处理组仔猪的十二指肠和回肠黏膜乳糖酶活性没有显著差异（P＞0.05）。在空肠黏膜乳糖酶活力上，抗生素组、微生态制剂组以及10%和20%发酵料组之间无显著差异（P＞0.05）；30%发酵料组较以上4个处理组有了显著（P＜0.05）提高。4.2.4发酵全价料对断奶仔猪肠道菌群的影响图4-2PCR-DGGE扩增电泳图Fig.4-2AmplicationelectrophoretogramofPCR-DGGE注：M：DL5KMarker（10025050075010001500200030005000bp）；1、2、3-4、5-6、7-8依次为抗生素组，微生态制剂组，10%、20%、30%发酵料组结肠；9、10、11-12、13-14、15-16依次为抗生素组，微生态制剂组，10%、20%、30%发酵料组仔猪直肠。37 河南农业大学2015届硕士学位论文DGGE上样前需检验PCR产物是否合格，由图4-2可以看出，该试验所选用的引物效果较好，PCR产物略小于500bp，电泳中条带较集中且无明显拖尾现象，可用于DGGE试验分析。4.2.4.1发酵全价料对仔猪肠道微生物菌群种类的影响仔猪结肠和直肠细菌菌群的DGGE图谱分析如Fig.4-3所示。由Fig.4-3可看出，不同仔猪以及同一仔猪的不同肠段处细菌的组成不相同，各处理组的主要条带存在差异，且20%、30%发酵饲料组仔猪结肠条带较多，各组仔猪结肠的条带数要多于直肠。说明发酵料组仔猪肠道的菌群种类较多，且结肠菌群的组成结构比直肠复杂。图4-3DGGE电泳细菌菌群图谱Fig.4-3BacterialcommunityofDGGEgraph注：1、2、3-4、5-6、7-8：依次为抗生素组，微生态制剂组，10%、20%、30%发酵料组结肠电泳；9、10、11-12、13-14、15-16：依次为抗生素组，微生态制剂组，10%、20%、30%发酵料组直肠电泳。4.2.4.2发酵无抗全价料对仔猪肠道微生物菌群相似性的影响图4-4DGGE条带聚类分析图Fig.4-4StripeclusteringanalysisdiagramfromDGGE注：J-1、J-2、J-A1、J-A2、J-B1、J-B2、J-C1、J-C2依次为抗生素组，微生态制剂组，10%、20%、30%发酵料组结肠条带；Z-1、Z-2、Z-A1、Z-A2、Z-B1、Z-B2、Z-C1、Z-C2依次为抗生素组，微生态制剂组，10%、20%、30%发酵料组直肠条带。38 河南农业大学2015届硕士学位论文仔猪结肠和直肠细菌菌群的相似性通过UPGAMA聚类分析如Fig.4-4所示。由该图知，仔猪肠道后段的菌群可聚类为两大类，抗生素组直肠、10%发酵料组直肠和20%发酵料组结肠中条带所代表的菌群归为一类，其它条带所代表的菌群则为第二类，这两类菌群的相似性系数分别为45%、42%。在结肠处，抗生素组和微生态制剂组的相似性系数均为74%；抗生素组和30%发酵料组之间的相似性系数最大为73%、最小为32%；20%发酵料组与抗生素组、微生态制剂组之间的相似性系数均为52%；20%发酵料组与30%发酵料组之间的相似性系数最大为52%、最小为32%；10%发酵料组与其余各组之间的相似性系数均为47%。在直肠，微生态制剂组与10%发酵料组之间相似性系数最大为83%、最小为32%；20%发酵料组与30%发酵料组之间的相似性系数最大为100%、最小为69%；抗生素组和30%发酵料组的相似性系数最大为81%、最小为32%；抗生素组与10%发酵料组之间相似性系数最大为45%、最小为32%；10%发酵料组与20%、30%发酵料组之间的相似性系数最大为42%、最小为32%。这些结果说明，仔猪直肠微生物菌群相似性系数高于结肠，各处理组间菌群差异较大，但相对较稳定。4.2.4.3发酵全价料对仔猪肠道微生物菌群多样性的影响表4-16DGGE微生物菌群的多样性指数Table4-16MicrobalfloradiversityindexfromDGGE组别Groups项目抗生素微生态制剂10%发酵料20%发酵料30%发酵料ItemsAntibioticsProbiotics10%FCF20%FCF30%FCF结肠Colon香农威尔指数1.261.871.861.761.8Shannonindex均衡度Evenness0.910.960.970.930.92丰富度Richness47777直肠Rectum香农指数0.611.511.741.881.34Shannonindex均衡度Evenness0.880.840.970.990.96丰富度Richness2667539 河南农业大学2015届硕士学位论文表4-17DGGE共性条带和差异性条带的序列比对结果Table4-17SequencealignmentresultsfromDGGEcommonanddifferentstripes条带号序列长度最相似菌种（序列号）相似性BlandnumbersequencelengthCloseststrain(accessionno.)Similarity1432bpUnculturedClostridiumsp.（KM244908.1）100%2434bpUnculturedbacterium（AB559585.1）99%4434bpUnculturedLachnospiraceaebacterium（JX230134.1）95%6403bpUnculturedbacterium（JN001300.1）100%8413bpUnculturedBlautiasp.（JX229330.1）95%9410bpLactobacillusalgidusstrain（NR_028617.1）87%10380bpUnculturedbacterium（JQ446830.1）99%11298bpUnculturedbacterium（GQ898063.1）92%14403bpLactobacillusacidophilus30SCstrain（NR_075049.1）99%16393bpCollinsellaaerofaciensstrain（KP233346.1）93%注：此表中条带是从图4-3DGGE图谱上的共性条带和特异性条带中筛选而来。通过QuantityOne以及Blast比对测序结果的分析，得出仔猪结肠和直肠微生物菌群的多样性指数和条带的相似性指数以及对应菌群种类见表4-16和4-17。由表4-16可知，相同处理不同肠段之间菌群的香农威尔指数存在差异，除20%发酵料组结肠菌群的香农指数低于直肠外，其它各处理组结肠均高于直肠；在结肠，抗生素组最低，微生态制剂组最高，且抗生素组均低于发酵料组；在直肠，抗生素组最低，20%发酵料组最高。抗生素组和微生态制剂组结肠的菌群均衡度高于直肠，而发酵饲料组结肠相对低于直肠，且抗生素组各肠段均低于发酵料组。各处理组结肠菌群的丰富度相对高于直肠，且抗生素组均低于发酵料组。由表4-17可以看出，通过回收测序所得的条带代表的细菌种类与现有数据库菌群的相似性较高，约40%的条带序列与未培养的细菌菌群的亲缘关系相对较近，相似性为99%～100%；约10%的系列与未培养的梭状芽孢杆菌的亲缘关系很近，相似性为100%；约10%的序列分别与未培养的Lachnospiraceaebacterium、Blautiasp.的亲缘关系相对较近，相似性均为95%；约20%的序列与乳酸菌类相似，相似性为87%-99%；10%的序列与产气柯林斯菌相似，相似性为93%。与特异性条带9和14所属菌群相似性最高的乳酸菌在20%、30%发酵料组仔猪的结肠和直肠中含量较高，且20%、30%发酵料组仔猪肠道内菌群种类多于其它处理组，说明发酵饲料可以在某种程度上改变仔猪肠道菌群的结构。4.3讨论4.3.1湿态发酵全价料对断奶仔猪粪样中微生物活菌数的影响通常体况良好的动物其肠道微生物菌群之间会保持平衡的状态，且乳酸菌和双歧杆菌40 河南农业大学2015届硕士学位论文等有益菌占主导地位，维护了肠道健康；而当机体遭受环境、日粮以及断奶等一系列应激变化时，大肠杆菌、沙门氏菌等一些（条件性）致病菌就会趁虚而入，破坏肠道微生物菌群结构，诱使动物机体消化机能发生紊乱，导致腹泻的发生，从而影响动物的生长发育。为缓解这种境况，需要在日粮中添加微生态制剂来改善或调节动物肠道菌群的失衡状态[70]。本试验研究发现，与抗生素组相比，微生态制剂组对断奶仔猪粪样中的微生物菌群结构没有太大影响；10%发酵饲料组显著降低了仔猪粪样中的大肠杆菌数，而20%、30%发酵饲料组乳酸菌分别显著提高了25.98%、26.73%，大肠杆菌显著降低了38.51%、32.39%。说明发酵饲料能有效改善其微生物菌群的平衡状态，促进仔猪肠道健康。4.3.2发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜形态结构的影响小肠是动物吸收营养物质的主要场所，也是易遭受病原菌侵害的部位，保持其肠道结构完整和健康，对于预防疾病就相当重要。小肠绒毛是储存营养物质的主要部位，其形态结构的变化在一定程度上会影响动物对营养物质的吸收面积和强度。小肠隐窝是由肠绒毛底端的上皮下陷至固有层所形成的管状结构。隐窝含有吸收细胞、杯状细胞、黏液细胞以及未分化细胞等。隐窝未分化细胞的多少和隐窝深浅度会影响绒毛的形态和其机能的发挥。所以，隐窝的深度在一定水平上能反应细胞的生成状况，缩小隐窝深度可以提高细胞的成熟率，增强其分泌功能。动物小肠绒毛高度与隐窝深度比值的大小与其功能的强弱呈正相关。研究表明提高动物小肠的绒毛高度在相应水平上能扩大小肠吸收营养物质的面积，进而增强小肠对营养物质的消化吸收和利用率[71]。李旋亮等[72]在做发酵饲料对断奶仔猪肠道黏膜形态影响的试验中发现，与基础日粮相比，发酵料组明显提高了肠道黏膜绒毛高度，并使十二指肠和空肠黏膜的隐窝深度变小，同时也显著增大了十二指肠、空肠黏膜绒毛VH/CD的比值。Cera等[73]报道仔猪在断奶后，其肠道黏膜会出现萎缩现象，导致黏膜上皮的绒毛长度变短，隐窝深度加大，从而减少了肠绒毛表面的成熟细胞，使小肠形态发生变化。肠道上皮内的淋巴细胞（iIELs）是动物的肠黏膜免疫系统中一种较早接触抗原、具有免疫活性的细胞，它是维护机体抗感染的第一道防线，在维持上皮细胞结构完整以及抵抗外来抗原的免疫应答中发挥重要作用[74-75]。本试验结果与上述结果相似，微生态制剂组对仔猪的小肠黏膜VH没有太大影响；10%、20%发酵饲料组能显著提高仔猪十二指肠黏膜的VH；各试验组均显著提高了空肠黏膜VH；20%、30%无抗发酵饲料组显著提高了回肠黏膜VH。同时，发酵料组还明显降低了仔猪十二指肠黏膜CD；30%发酵饲料组显著降低空肠黏膜CD19.54%；20%和30%发酵饲料组分别显著降低回肠黏膜CD31.89%、28.66%。20%发酵饲料能显著增加仔猪小肠黏膜VH/CD的比值和十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数。说明发酵饲料能维护断奶仔猪肠道黏膜结构完整与健康。41 河南农业大学2015届硕士学位论文4.3.3发酵全价料对断奶仔猪小肠黏膜二糖酶活的影响通常日粮中含有50%～80%的碳水化合物，而二糖需在小肠中二糖酶的作用下水解成小分子的单糖后才可被动物吸收利用，二糖酶主要存在于小肠黏膜柱状细胞的刷状缘内，并广泛分布在动物的肠道黏膜和内容物中[76-77]。麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶是衡量仔猪肠道发育成熟、功能健全与否的关键类消化酶。麦芽糖酶和蔗糖酶活性的发育模式相类似，在仔猪胚胎期较低，出生2周时缓慢升高，3周后迅速增长并趋于稳定；乳糖酶活性在胚胎期较高，出生时达到最高并持续1周左右，出生3周左右后先迅速再缓慢较低[78-79]。本试验结果表明微生态制剂组除了显著增加仔猪的空肠黏膜蔗糖酶活性外，而对小肠的麦芽糖酶和乳糖酶活性没有明显影响；与抗生素组相比，发酵饲料组大多都能使仔猪的十二指肠黏膜麦芽糖酶和空肠黏膜蔗糖酶活性显著增加；30%发酵饲料组能明显提高仔猪空肠黏膜乳糖酶活性，对仔猪空肠和回肠黏膜麦芽糖酶活、十二指肠和回肠黏膜蔗糖酶活、乳糖酶活没有太大影响，但有一定的提高。说明发酵饲料可以不同程度地提高仔猪二糖酶活性，促进其对饲料中营养物质的消化吸收，进而提高其生产性能。4.3.4发酵全价料对断奶仔猪肠道菌群的影响动物的肠道菌群既能保护其肠道和免疫系统免受病原菌等有害微生物的侵害，还能在某种程度上促进营养物质的消化吸收，在动物生长发育过程中发挥了重要作用[80-81]。而断奶是仔猪生长发育过程中遭受较大的一次应激，特别是此阶段日粮的转变会影响其肠道生理机能和形态结构，导致肠道微生物菌群的平衡状态受到破坏（Giang等，2012）。Konstantinov等试验研究发现，仔猪断奶在一定程度上会促使其肠道的微生物菌群结构发生显著的变化，主要表现在大肠杆菌等有害菌数量逐渐增多，而乳酸菌等有益菌数量则明显减少[82]。DGGE凝胶电泳中检测出的条带所处的不同位置代表了微生物菌群的种类，电泳中条带的数量及其所存在的位置能反应微生物菌群的多样性，条带丰富度的大小反应了细菌数量的多少且哪些会成为优势菌[83]。从本试验DGGE图谱可知，仔猪结肠的主要条带数多于直肠，且发酵料组的条带数多于抗生素组和微生态制剂组，说明发酵料可以增加仔猪肠道有益微生物菌群的数量，促进肠道菌群的平衡。这与何贝贝等[84]的试验结果生长性能高的猪其肠道优势菌群较多相一致。DGGE电泳中条带相似性指数能反应微生物菌群间的相似度。相似性指数越高，表明肠道微生物菌群的相似度就越高，其菌群间的差异就越小，菌群结构就相对较稳定[85]，就不会轻易受到外界的干扰。本试验结果可知，抗生素组和微生态制剂组、10%发酵料组结肠微生物菌群的相似性分别为73%、76%，与20%、30%发酵料组的最高相似性系数分别为66%、80%。抗生素组与微生态制剂组直肠菌群的相似性为42%，与10%、20%、30%发酵料组的最高相似性分别为45%、91%、91%。说明微生态制剂组和10%发酵料组对仔42 河南农业大学2015届硕士学位论文猪直肠菌群的相似性影响较大，而20%、30%发酵料组则对其结肠菌群相似性影响较大。微生物菌群的多样性通常用香农威尔指数来表示，它能反应菌群的种群数量、种群间分布的均衡度以及所存在的常见菌群[86]。微生物菌群的数量越多，菌群分布越均匀，菌群间的相互作用就越强，就越能抵制各种应激和环境变化的干扰，从而更好地保护菌群不受侵害[87-88]。与此一致，McCann在探讨物种稳定性的报道中也指出了动物肠道微生物菌群的多样性可能与其对外界的抗干扰程度有关，细菌菌群的多样性指数增大了，病原菌对其侵害程度就会相对变小，肠道菌群就会保持相对稳定的状态，从而促进断奶仔猪的生长[89]。试验研究发现，相同处理不同肠段之间菌群的香农指数存在差异，除20%发酵料组结肠菌群的香农指数低于直肠外，其它各处理组结肠均高于直肠；在结肠，抗生素组最低，微生态制剂组最高，且抗生素组均低于发酵料组；在直肠，抗生素组最低，20%发酵料组最高。抗生素组和微生态制剂组结肠的菌群均衡度高于直肠，而发酵饲料组则结肠相对低于直肠，且抗生素组各肠段均低于发酵料组。各处理组结肠菌群的丰富度相对高于直肠，且抗生素组均低于发酵料组。表明发酵饲料会影响肠道菌群的多样性，增加了菌群的种类及其数量，增强了菌群的平衡度，更好地维护了肠道健康。本试验通过分析DGGE电泳图谱和blast比对结果发现，仔猪结肠和直肠检测到的细菌大多都是不可培养的，胡远亮的试验中也出现了类似结果，他分析可能是由于动物肠道内的生长环境有些复杂，而绝大多数的微生物菌群在目前的实验室条件下不容易培养出来[90]。李小永[91]试验研究发现，通过常规分离与培养的方法筛选到的优势菌种与DGGE分析所得到的不一致。出现此种差异可能跟常规的培养方法会对微生物产生选择性有关，由此得出的特定环境中微生物的多样性可能就会偏离实际，就如某些低丰度的微生物在适宜的人工培养条件下会快速生长而成为优势菌，而那些高丰度的微生物则由于培养条件不适宜而未被培养出来[92]。4.4小结（1）与抗生素组相比，20%、30%无抗发酵全价料组能显著提高断奶仔猪粪样中乳酸菌的活菌数，且发酵饲料组均可显著降低大肠杆菌活菌数，对酵母菌活菌数有一定的提高。（2）与抗生素组相比，发酵饲料组均显著增加了仔猪空肠VH；且10%、20%发酵饲料组显著增加了十二指肠VH；20%、30%发酵饲料组显著增加了回肠VH；各发酵饲料组均显著降低了十二指肠CD；30%发挥饲料组可显著降低空肠和回肠CD，20%发酵饲料组则显著降低了仔猪回肠CD和提高其十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞数。（3）与抗生素组相比，30%发酵料组可显著提高仔猪空肠乳糖酶活性，各发酵料组均可显著提高十二指肠麦芽糖酶活和空肠蔗糖酶活。（4）与抗生素组和微生态制剂组相比，发酵料组可明显增加仔猪肠道微生物菌群的种类和有益菌群的数量，提高菌群的多样性和均衡度，改善肠道菌群的平衡和健康。43 河南农业大学2015届硕士学位论文5结论从本试验结果可看出，饲粮中添加适量的湿态发酵全价料可显著提高仔猪日增重、IgM含量、粪样中乳酸菌数、小肠黏膜VH、十二指肠麦芽糖酶活、空肠蔗糖和乳糖酶活以及增加有益菌群的种类和数量，降低了肠黏膜隐窝深度、粪样中大肠杆菌数和腹泻率。故发酵料可替代抗生素，有效降低断奶应激，且以20%的添加量效果最好。44 河南农业大学2015届硕士学位论文参考文献[1]SmithF,ClarkJE,OvermanBL,TozelCC,HuangJH,RivierJE,BlisklagerAT,MoeserAJ.Earlyweaningstressimpairsdevelopmentofmucosalbarrierfunctionintheporcineintestine[J].AmericanJournalofphysiology-GastrointestinalandLiverphysiology,2010,298:G352-G363.[2]HampsonD.Alterationsinpigletsmallintestinalstructureatweaning[J].Researchinveterinaryscience,1986,40:32-40.[3]BuddleJ,BoltonJ.Thepathophysiologyofdiarrhoeainpigs[J].PigNewsandinformation,1992.[4]RamsayAJ,HusbandAJ,RamshawIA,BaoS,MatthaeiKI,KoehlerG,KopfM.Theroleofinterleukin-6inmucosalIgAantibodyresponsesinvivo[J].Science,1994,264:561-563.[5]王恬,钟翔.仔猪肠黏膜营养与肠道修复[J].饲料工业,2008(2):2-7.[6]沈志勇,牛钟相,彭军等.鸡消化道正常菌群的研究进展[J].动物医学进展,2003,24(6):61-63.[7]BergRD.Theindigenousgastrointestinalmicroflora[J].Trendsinmicrobiology,1996,4(11):430-435.[8]DeVreseM,MarteauPR.Probioticsandprebiotics:effectsondiarrhea[J].TheJournalofnutrition,2007,137(3):803S-811S.[9]ZoetendalEG,CollierCT,KoikeS,etal.Molecularecologicalanalysisofthegastrointestinalmicrobiota:areview[J].TheJournalofnutrition,2004,134(2):465-472.[10]IshiiK,NakagawaT,FukuiM.Applicationofdenaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE)inmicrobialecology[J].MicroandEnviro,2000,15：59-73．[11]李雪驼.随机比较中国大连地区和日本大阪地区健康成年人及老年人肠内细菌结构的研究.中国微生态学杂志,1999,11：278-281.[12]GuX,LiD,SheR.Effectofweaningonsmallintestinalstructureandfunctioninthepiglet[J].ArchAnimalNutri,2002,56：275-286.[13]PachaJ.Developmentofintestinaltransportfunctioninmammals[J].PHysiolRev,2000,80：1633-1667.[14]PluskeJR,HampsonDJ,WilliamsIH.Factorsinfluencingthestructureandfunctionofthesmallintestineintheweanedpig:areview[J].Livestockproductionscience,1997,51(1):215-236.[15]BoudryG,PéronV,LeHuërou-LuronI,etal.Weaninginducesbothtransientandlonglastingmodificationsofabsorptive,secretory,andbarrierpropertiesofpigletintestine[J].TheJournalofnutrition,2004,134(9):2256-2262.[16]TangM,LaarveldB,VanKesselAG,etal.Effectofsegregatedearlyweaningonpostweaningsmallintestinaldevelopmentinpigs[J].JOURNALOFANIMALSCIENCE-MENASHATHEN45 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河南农业大学2015届硕士学位论文EFFECTSOFWETFERMENTEDCOMPLETEFEEDWITHOUTANTIBIOTICONPERFORMANCE,INTESTINALDEVELOPMENTANDMICROFLORAINWEANEDPIGLETSSupervisor:AssociateProf.LiZhentianMasterCandidate:HeRufangABSTRACT:Thisexperimentwasconductedtostudytheeffectsofdietsaddedwithdifferentlevelsofwetfermentedcompletefeedonperformance,CPdigestibility,serumindex,intestinalmorphologyanddisacchridaseactivities,aswellasmicro-floraonweanlingpiglets.Atotalof160weaningpigletswithgoodhealthandweightat(8.20±0.16)kgwereallocatedto5dietarytreatments(4penspertreatmentand8pigsperpen):1)basaldietplus20mgcolistand12mgenramycin(antibiotics);2)basaldietplus0.1%bacillussubtilisandlicheniformiscompounds(probiotics),3)fermentedfeedalternate10%basaldietwithoutantibiotic(10%fermentedfeed);4)fermentedfeedalternate20%basaldietwithoutantibiotic(20%fermentedfeed);5)fermentedfeedalternate30%basaldietwithoutantibiotic(30%fermentedfeed).Thisassaycontainstwoparts,theresultsasfollow:Experiment1:(1)comparewithantibioticsandprobioticsgroups,20%、30%fermentedfeedgroupssignificantly（P＜0.05）improvedADG;comparewithantibiotics,fermentedfeedgroupsreduced（P＜0.05）diarrhearate,hadatendencytoreduceF/Gbuthadnodifference(P＞0.05);alltreatmentgroupshadnodifferenceonADFIofpiglets.(2)addedappropriatefermentedfeedtodietshadsomeimprove(P＞0.05)onCPdigestibility.(3)comparewithantibioticsgroup,10%、30%fermentedfeedgroupsincreased（P＜0.05）globulininserum;30%fermentedfeedgroupimprove（P＜0.05）IgMcontent,fermentedfeedgroupshadfewinfluence(P＞0.05)onotherserumindex,whiletheycouldimprovetotalproteinandimmuneglobulincontentsinserumtosomeextent.Comparewithprobioticsgroup,20%fermentedfeedgroupincreased（P＜0.05）bloodglucose;thefermentedfeedgroupsdecrease（P＜0.05）ureanitrogenlevel,whilehadnoinfluence(P＞0.05)onASTandALTactivity,TGandTCcontent.Experiment2:(1)comparewithantibioticsandprobioticsgroups,20%、30%fermentedfeedgroupsimproved（P＜0.05）Lacticacidbacteriamicrobialnumbersinfaecalofpiglets,thefermentedfeedgroupsalldecrease（P＜0.05）E.colimicrobialnumber,hadatendencytoimprove(P＞0.05)yeastnumbers.(2)comparewithantibioticsgroup,fermentedfeedgroupsincreased（P＜0.05）VHandVH/CDofjejunum,reduced（P＜0.05）CDofduodenum;10%and20%fermentedfeedgroupsincreased（P＜0.05)VHandVH/CDofduodenum;20%and30%fermentedfeedgroupincreased（P＜0.05）VHandVH/CDofileum,reduced（P＜0.05）CDof51 河南农业大学2015届硕士学位论文ileum;20%fermentedfeedgroupincreased（P＜0.05）IELsnumberofduodenummucosa.(3)comparewithantibioticsgroup,fermentedfeedgroupsimprovedsucraseactivityinjejunum;20%and30%fermentedfeedgroupimproved（P＜0.05）maltaseactivityinduodenum,30%fermentedfeedgroupimproved（P＜0.05）lactaseactivityinjejunum.(4)probioticsgroupand10%fermentedfeedgrouphadagreaterinfluenceonrectumflorathanothergroups,while20%and30%fermentedfeedgroupshadagreaterimpactoncolon;themosttreatmentgroupshadabiggerdiversityindexincolonthanrectumexcept20%fermentedfeedgroup,moreoverantibioticsgrouplowerthanfermentedfeedgroups;thefloraevennessandrichnessofantibioticsandprobioticsgroupsincolonwerehigherthanrectum,theantibioticsgroupwaslowerthanfermentedfeedgroups.Theresultsshowthatsupplementedwithappropriatewetfermentedcompletefeedtodietscouldimproveperformance,maintainintestinalmucosamorphologicalstructureintegrityandmicrobebalance,strengthenpremonitionandanti-stresscapability.Keywords:Antibiotics;Probiotics;FermentedCompleteFeed;WeaningPiglets;Performance;IntestinalDevelopment;IntestinalMicroflora52