水稻脆鞘基因bsh1的图位克隆与功能分析

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4、之后开始形成的，主要存在于厚壁组织和木质部。深入研究细胞壁合成和装配相关的基因可以帮助我们了解植物机械强度形成的分子机制。本研究鉴定了一个水稻矮化脆鞘的突变体bsh1，通过图位克隆定位了BSH1，并利用分子生物学实验初步研究了BSH1的生物学功能。主要结果如下：1.水稻脆鞘突变体bsh1的表型分析突变体bsh1在成熟期的株高、千粒重和单株产量都显著下降。bsh1最显著的变异是6周幼苗叶鞘的机械强度比野生型低，叶鞘变脆。透射电镜观察叶鞘厚壁细胞，发现bsh1的细胞壁厚度降低。进一步分析野生型和突变体的细胞壁成分，结果显示主要的细胞壁成分含量都不同程度地下降。2.BSH1编码细胞色

5、素P450CYP96B4利用图位克隆的方法，将突变基因精细定位在28kb区间内，通过测序发现在第二个ORF，即CYP96B4的启动子区有一个未知长度的片段插入，并且突变体CYP96B4的表达量下降，因此我们将CYP96B4作为BSH1的候选基因。互补试验表明CYP96B4表达量升高的转基因植株表型与野生型类似，干扰植株中CYP96B4表达量下降的植株表型与突变体类似。因此，我们可以确定CYP96B4就是造成突变体bsh1矮化和脆鞘的BSH1基因。3.BSH1的亚细胞定位和时空表达模式观察BSH1与GFP融合蛋白的亚细胞定位，发现BSH1与内质网Marker共定位，说明BSH1蛋

6、白定位于内质网。定量PCR结果显示BSH1在叶鞘中表达量最高，在根中最低。GUS染色分析表明BSH1在胚芽鞘、叶鞘、茎秆、叶片、根和穗子中都有表达。胚芽鞘和叶片的横切可以看到GUS着色在维管束中，而叶鞘着色则在维管束周围的细胞，根中的染色带与厚壁细胞重叠。在第一节间较为幼嫩的部位有较深的染色。成熟组织中也检测到了GUS活性，例如穗轴和小花，而且小花的染色会随着小花的成熟扩展到整个颖壳。4.BSH1的功能分析在进化上，CYP96家族的成员被分为两个分支，一支是包含OsCYP96B4的单子叶分支，另一支是包含AtCYP96A15的双子叶分支。已经报道的CYP96家族的成员的功能多样

7、，既有负责脂肪酸修饰的基因，也有与抗病、抗逆相关的基因，但是大部分CYP96家族成员的功能未知。脂肪酸成分的检测结果表明bsh1蜡质总量从野生型950.70μg/g下降到突变体393.16μg/g，详细分析发现每一种蜡质成分含量都显著下降，包括C30-C34的醛类，C29-C41的烷烃，C22-C32的脂肪酸和C26-C30的伯醇。而bsh1中角质、细胞内脂肪酸和种子内脂肪酸的变化不显著。这些结果说明BSH1的功能与超长链脂肪酸及其衍生物的合成有关。对细胞壁合成基因表达量的分析结果显示，所有