水牛囊胚发育阶段对原始态始发态胚胎干细胞分离培养的影响

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1、巧古单化？ｉＩ．Ｖ．论文１、‘，＞．■Ｖ．ｒ：；．．．．．ｉ．＇叫’＾巧．：＇水牛囊胚发育阶段对原始态／始发态巧胎干细胞分离培养的影响．．＇，阮秋燕＇，户■■．：，＇＼－－？？．／、邏：｜｜二。－五年六月Ｍ分类号％１４乂卷敬公开ＵＤＣ硕壬学位论文水牛裹胚发育阶段对原始态／始发态胚胎干细胞分离培养的影响阮秋燕学科专业动物遗传育种与繁殖指导教师陆凤巧研究员杨素芳教授论义答雜日期２

2、０１５年５月２６日学位授予日期答辩委员会主席卢巧焕教授广西大学学位论文原创性和使用授权库明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研巧所取得的研巧成果。除己特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研巧成果，也不包含本人或他人一为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我同工作的同事对本论文的研巧工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分

3、使用权，即：学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅，可将学位论文的全部或部分内容编、入有关数据库进行检索和传播，可Ｗ采用影印缩印或其它复制手段保存。、汇编学位论文本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。垃＾保密。＂＂（请在Ｗ上相应方框内打Ｖ）论文作者签名■；勺：矜抑装日期＾－日期分＇＾指导教师签名；）：作者联系电话：电子邮箱水牛囊胚发育阶段对原始态／始发态胚腊干细胞分离培养的影晌摘要胚胎丰细施（Ｅｍｂｒｙｏｎ

4、ｉｃＳｔｅｍＣｄｌｓ，ＥＳＣｓ）的建系受其细胞来源及培养环境等多种因素的影响，其中来自裹胚的ＥＳＣｓ受裹胚所处发育阶段的影响最大一。囊赃形成到裹胚植入子宫壁期间，其多能性细胞处于种不断自我更新和分化的过程，可能同时存在不同状态的多能性细胞并最终决定其衍生的ＥＳＣｓ的多能性状态。因此，本研究拟探讨不同发育阶段胚胎的多能性基因表达模式及其对分离培养水牛类ＥＳＣｓ效果的影响，并分析其所处ｉ的多能性状态，Ｕｌ期确定适合水牛类ＥＳＣｓ分离培养的囊胚发育阶段。首先，对水牛不同发育阶段早期胚胎（桑植化、

5、早期寞胚、囊胚、扩张囊胚和解化囊胚）的多能性相关基因的表达模式进行了分析，发现多能性基因主要在桑權胚和早期裹胚表达，原始态相关基因ＫＬＦ４、ＴＢＸ３和一ＲＥＸ－１在这两个阶段高水平表达；囊胚是个相对沉默的基因表达时期，－大部分多能性基因表达下调；扩张裹胚中ＫＬＦ４、ＴＢＸ３和ＲＥＸ１表达量较低且高表达始发态相关基因ＦＧＦ５。对培养至第５天的水牛胚胎进行２ｉ（１｜ｉｍｏｌ／ｍＬＰＤ０３２Ｗ０１，３ｎｍｏｌ／ｍＬＣＨＩＲ９９０２１）培养处理，发现２ｉ培养处理对水牛堯胚形成、裹胚细胞数、及

6、内细胞团含量无显著影响，其多能性基因表达模式与非处理组相似，但表达量均显著低于对照组；其多能性沉默阶段延长至扩张囊胚和解化囊胚。其次，比较了不同发育阶段裹胚对分离培养水牛类ＥＳＣｓ的效果，并对所获得的类ＥＳＣｓ进斤了生物学特性分析。结果发现，扩张裹胚和解化囊胚Ｉ的ｉＩＣＭ的贴壁率和原始克隆形成率均显著高于早期裹胚和裹胚；２培养处＜理早期胚胎后，解化囊胚源原始克隆直径显著大于对照组（戶〇．〇５）；对不同来源水牛类ＥＳＣｓ原代克隆进行核也转录因子表达分析发现，其ＯＣＴ４的表达不受裹胚时期来源

7、和２ｉ处理早期化胎的影响，ＮＡＮＯＧ和Ｓ０Ｘ２在扩张襄巧源类ＥＳＣｓ的相对表达显著高于赔化囊胚源类ＥＳＣｓ，２ｉ处理早期胚ＫＬＦ４－胎组原始态基因、ＴＢＸ３和ＲＥＸ１的表达高于对照组，僻化囊胚ＴＢＸ３－和ＲＥＸ１表达显著高于扩张囊胚源类ＥＳＣｓ。对传代培养的水牛类ＥＳＣｓ进行生物学特性分析，发现细胞呈克隆样生长，表达多能性转录因子０ＣＴ４、－ＭＹＣＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、Ｃ、ＣＤＨ１、ＫＬＦ４和ＴＢＸ３；免疫焚光染色发现，ＯＣＴ４－、ＳＯＸ２蛋白，弱表达ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ４和ＴＲＡ＾６０表面抗

8、原其表达；经诱导能形成可表达ＧＡＴＡ４、ＴＵＢＢ３、ＡＣＴＡ２和ＡＦＰＨ个胚层标记基因的拟胚体，能分化形成成纤维样、上皮样和神经样细胞。最后，通过检测细胞Ｘ性染色体活性状态、相关多能性基因表达情况和对不同多能性信号的反应，分析雌性水牛类ＥＳＣｓ所处的多能性状态。一－结果显示；雌性水牛