低聚木糖对应激大鼠肠粘膜屏障功能的影响

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分类号：R459.6密级：不保密UDC：610学校代码：11065硕士学位论文低聚木糖对应激大鼠肠粘膜屏障功能的影响刘均杰指导教师丁连安教授学科专业名称外科学（普外）论文答辩日期2015年5月26日 摘要目的研究大鼠饮食中添加低聚木糖对电刺激-束缚应激大鼠肠屏障功能的影响。方法40只Wistar大鼠随机分成正常对照组、低聚木糖组、应激组和低聚木糖+应激组，每组10只，正常对照组仅给予基础饮食，低聚木糖组每天以2g/kg的剂量灌胃补充低聚木糖；应激组大鼠于普通饮食喂养第12天，被束缚固定后每天给予电刺激束缚3h，持续2周，制备应激模型；低聚木糖+应激组在每天给予低聚木糖（2g/L）喂养同时，于第12天制备应激模型。建模成功后，各组大鼠经腹主动脉采血，检测血清D-乳酸、二胺氧化酶（DAO)浓度；处死大鼠，取回肠组织行病理检查并测定肠粘膜形态学参数及肠液SIgA含量。结果与对照组相比，应激组及低聚木糖+应激组血浆D-乳酸、DAO浓度均明显增高（P<0.05）并呈正相关；应激组血浆D-乳酸、DAO浓度又明显高于低聚木糖+应激组（p<0.05）;对照组与低聚木糖组间血清学指标的差异无统计学意义（p>0.05)；应激组及低聚木糖+应激组大鼠肠粘膜形态学参数数值和肠液SIgA含量均较正常对照组显著降低(p<0.05)，应激组又明显低于低聚木糖+应激组（p<0.05),而低聚木糖组显著高于对照组(p<0.05)。结论添加低聚木糖喂养可以降低大鼠血浆D-乳酸、二胺氧化酶浓度，改善肠粘膜形态及功能，提示低聚木糖在一定程度上具有维护肠粘膜屏障功能的作用。硕士研究生：刘均杰（普通外科学）指导教师：丁连安教授关键词：应激；肠粘膜屏障；D-乳酸；二胺氧化酶；低聚木糖 AbstractObjective：Tostudytheeffectofthexylo—oligosaccharide(XOS)addedinthedietontheinjuredintestinalmucousmembranebarriercausedbyelectricityrestraintstress.Methods：Fortywistarratswererandomlydividedintogroups:twoelectricresistantstress(ERS)groupsfedwitheitheranormaldiet(ERSgroup)or2g/kgXOSperday(ERS+XOSgroup)andtwoshamERSgroupsfedwithanormaldiet(controlgroup)or2g/kgXOSperday（XOSgroup).Allthefourgroupswerefedforatotalof26days,andtheERSandERS+XOSgroupsweresubjectedtoelectricrestraintstressstartingfromthe12thday,for2weeks.ThenthebloodsamplesofallthefourgroupswerecollectedviaabdominalaortapuncturefordeterminationofserumD-lactateanddiamineoxidas(DAO)activity;finallyalltheratsweresacrificedandtheintestinaltissueswerecollectedforexaminationofpathologicaltissue,membranemorphologyandSIgAcontents.Results：Comparedwiththecontrol,theserumD-lactateandDAOlevelsofERSgroupandtheERS+XOSgroupweresignificantlyincreasedandpositivelycorrelated(p<0.05);andthatintheERSgroupwassignificantlyhigherthanthatintheERS+XOSgroup(p<0.05);thelevelsofserumD-lactateandDAOwerenotsignificantlydifferentbetweenthecontrolandtheXOSgroups(p>0.05).TheparametervaluesofintestinalmembranemorphologyandSIgAcontentsoftheERSgroupandERS+XOSgroupwereobviouslydeclinedbycomparisonwiththecontrolgroup(p<0.05);andthatintheERSgroupwassignificantlydecreasedthanthatintheERS+XOSgroup(p<0.05);butthatintheERS+XOSgroupweresignificantlyincreasedthanthatinthecontrolgroup(p<0.05).Conclusion：FeedingwithXOScandecreasetheserumconcentrationofD-lactateandDAOinratsandimproveintestinalmucosamorpologyandfunction,suggestingthatXOSmayhavetomaintainintestinalbarrierfunction.Postgraduatestudent:JunjieLiu(GeneralSurgery)Directedbyprof.LiananDingKeywords:Stress;Intestinalmucosalbarrier;D-lacticacid;Diamineoxidase;Xylo-oligoosaccharides 目录引言·······································································································1第1章资料与方法···················································································21.1实验动物及药品··················································································21.2主要仪器···························································································21.3.实验动物分组····················································································21.4.实验方法··························································································21.4.1动物模型的制备················································································21.4.2大鼠回肠组织HE染色观测肠粘膜形态···················································41.4.3血清D-乳酸、DAO浓度检测·································································51.4.4D-乳酸、DAO标准曲线·······································································61.4.5小肠粘液SIgA含量的测定··································································81.5数据处理···························································································8第2章结果·····························································································92.1大鼠回肠黏膜形态学变化······································································92.2血清D-乳酸和DAO浓度的变化·······························································92.3相关性检测·······················································································102.4低聚木糖对应激大鼠肠道SIgA含量的影响··············································10第3章讨论···························································································12第4章结论···························································································15参考文献································································································16综述······································································································18综述参考文献··························································································24攻读学位期间的研究成果··········································································28致谢······································································································29学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明·········································30 引言低聚木糖对应激大鼠肠黏膜屏障功能的影响引言常见消化系统疾病，如功能性消化不良、肠易激综合征和消化性溃疡等的发病或加重与生活中应激事件密切相关。到目前为止应激引起消化道功能障碍的具体机制尚不明确，但急、慢性应激均可引起肠上皮细胞通透性增加，肠屏障功能受损等病理生理改变[1]。益生元是一种膳食补充剂，通过选择性刺激一种或少数种菌的生长或增加其活性而对寄主产生有益影响并改善寄主肠道菌群稳态。益生元中最具代表者-低聚木糖（Xylo-oligoosaccharides),是由2~7个木糖分子以β-1,4糖苷键连合形成的功能性聚合糖，是目前所有低聚木糖中性能最稳定的益菌因子，其增殖双歧杆菌的作用是其他同类低聚糖的5~20倍，现又被誉为“超强双歧因子”[2]，具有很强的增殖双歧杆菌的功效，且增殖双歧杆菌的选择性很高[3]，不易被消化吸收直接进入肠内为双歧杆菌优先利用，双歧杆菌可对应激大鼠肠道细菌移位、肠道通透性改变具有减缓作用；王玉玉等[4]研究表明在慢性应激大鼠模型中，使用双歧杆菌可有效缓解肠道功能紊乱，降低肠粘膜通透性。本实验旨在探讨合理补充低聚木糖对电刺激束缚大鼠肠粘膜的保护作用，为低聚木糖成为肠道营养食品提供理论据。1 第一章材料与方法第一章材料与方法1.1实验动物及药品6周龄健康雄性Wistar大鼠40只，体质量150~160g，清洁级（青岛市药品检验所实验动物中心提供）；低聚木糖粉（等级：XOS-95型山东龙力生物科技股份有限公司）。1.2主要仪器G6805-2电针治疗仪（青岛鑫升）；台式高速离心机（湖南恒诺仪器设备有限公司）；全自动酶标仪（美国）；紫外光分光光度计（上海元析仪器有限公司）；超低温冰箱（青岛海尔）；光学显微镜（日本多美公司）；医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）等。1.3实验动物分组本实验用40只Wistar大鼠随机分成四组：正常对照组、低聚木糖组、应激组和低聚木糖+应激组，每组10只大鼠。1.4实验方法1.4.1动物模型的制备正常对照组大鼠在笼中自由活动，仅接受普通饲料、无菌水喂养；低聚木糖组每天以2g/kg的剂量经灌胃补充低聚木糖，余处理同对照组；应激组大鼠于普通喂养第12天，被固定于专门的束缚器具中，限制活动，每天给予电刺激3小时，然后解除束缚，将大鼠放回笼中，持续2周；低聚木糖+应激组大鼠每天以2g/kg的剂量经灌胃补充低聚木糖同时，于喂养后第12天，采用与应激组相同的方法制备模型。（见图1.4.1）2 青岛大学硕士学位论文图1.4.1电刺激-束缚应激大鼠模型3 第一章材料与方法1.4.2大鼠回肠组织HE染色观测肠粘膜形态取回肠肠段黏膜组织↓平置于10%甲醛中固定↓经不同浓度乙醇脱水、二甲苯透明↓浸腊并制成蜡块包埋↓将蜡块切成4~5μm，置60℃烘箱内烤片20min↓切片经过二甲苯脱蜡，用各级乙醇至水洗↓经苏木素染色8min，自来水冲洗↓75%乙醇盐酸分化30s↓自来水浸泡20min（吸干水）↓置伊红液复染2min↓先经乙醇脱水，再用二甲苯透明，最后中性树脂封片↓镜检观测光镜下观察大鼠回肠黏膜病理切片，并采用医学图像分析仪测量肠粘膜形态学参数（肠绒毛宽度、高度，腺隐窝深度及肠粘膜厚度）。4 青岛大学硕士学位论文1.4.3血清D-乳酸、DAO浓度检测1.建模成功后予10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，于腹主动脉取血2ml，然后于4℃5000rpm离心25min，转移上清液至新管，10000rpm常温离心5min，再次转移上清液至新管，于-80℃保存。2.用ELISA法测定大鼠血清D-乳酸、DAO浓度。①标准品稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加入标准品100μl，然后在第一、第二孔中均加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔中，再在第三、第四孔分别加入标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九和第十孔中各取50μl弃掉。稀释后各孔加样量均为50μl，D-乳酸浓度配制为1200μg/L，800μg/L，400μg/L，200μg/L，100μg/L；DAO浓度分别为6000pg/ml，4000pg/ml，2000pg/ml，1000pg/ml，500pg/ml。②加样：设空白孔和待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。③温育：用封板膜覆盖置37℃温育，反应时间为30分钟。④配液：用蒸馏水将浓缩洗涤液稀释后待用。⑤洗涤：轻轻揭掉封板膜，弃去液体并甩干，每孔加入洗涤液洗涤，浸泡30秒后弃去，如此重复6次，再拍干。⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl（空白孔除外）。⑦再次温育、洗涤：同上述操作。⑧显色：先向每个孔里加入显色剂A50μl，然后再加入显色剂B50μl，轻轻来回振荡混匀，37℃避光显色时间为15min。⑨终止：向每孔加入终止液50μl终止反应。⑩测定并绘制标准曲线：用空白孔调零，在450nm波长处依次测量各孔的OD5 第一章材料与方法值。终止完成15min内进行测定。以标准物浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数。4.封板膜只限一次性使用，以避免引起交叉污染。5.底物请注意避光保存。6.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.7.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。8.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。9.本试剂不同批号组分不得混用。10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。1.4.4.D-乳酸、DAO标准曲线经计算D-乳酸回归曲线和相关系数为R2=0.9981，DAO的相关系数为R2=0.9987两者均可计算相应物质的浓度，所建回归方程分别为：y(D-乳酸浓度)=628.98X（OD值）-46.164；y(DAO浓度)=3103.7X（OD值）-175.58。6 青岛大学硕士学位论文1.4.4.1D-乳酸的标准曲线1.4.4.2DAO的标准曲线7 第一章材料与方法1.4.5小肠粘液SIgA含量的测定大鼠麻醉后，消毒皮肤，逐一切开皮下组织，打开腹腔，观察腹腔脏器，取屈氏韧带5cm以下空肠肠段10cm，用冷蒸馏水、磷酸盐缓冲液（ABS)流动冲洗，然后平铺于滤纸上，纵向切开肠腔，暴露黏膜面，4℃磷酸盐缓冲液（PBS)缓慢冲洗，用清洁载玻片轻轻刮去黏膜上附着的粘液，并用微量注射器收集0.5ml，用4.5mlPBS稀释并小心搅匀，使其充分溶解，1000×g低温离心20min，留取上清液，于-20℃保存备用。SIgA的测定采用ELISA法，检测步骤参照试剂盒说明书，将所得数据整理并绘制图表。1.5数据处理应用SPSS19.0统计软件包处理数据。实验数据用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析、t检验及Pearson相关分析，以p<0.05为差异有统计学意义。8 第二章结果第二章结果2.1大鼠回肠黏膜形态学变化正常对照组、低聚木糖组回肠黏膜组织连续完整，绒毛排列整齐，黏膜上皮细胞形态正常，未见组织水肿、炎性细胞浸润等表现，低聚木糖组大鼠腺隐窝深度、肠粘膜厚度和绒毛宽度均较对照组明显增加（p<0.05)；应激组大鼠肠粘膜绒毛稀疏、萎缩，黏膜水肿，其绒毛宽度和高度、腺隐窝深度均较正常对照组显著减少（p<0.05)；低聚木糖+应激组绒毛宽度、腺隐窝深度、肠粘膜厚度均较应激组明显增加（p<0.05)。（见图2.1、表2.1）ABCD图2.1光镜下各组大鼠回肠粘膜组织结构变化（HE×100)注：A正常对照组B低聚木糖组C应激组D低聚木糖+应激组表2.1各组大鼠回肠黏膜形态学参数的比较组别绒毛宽度（µm)绒毛高度（µm）腺隐窝深度（µm）肠粘膜厚度（µm）正常对照组120.51±4.52390.62±3.88188.86±5.35569.72±3.06低聚木糖组134.62±5.02a396.50±9.04200.97±3.34a587.68±6.62a应激组89.21±6.70a370.97±4.11a156.82±8.29a564.87±9.27低聚木糖+应激组110.71±5.72b373.04±6.05a182.62±5.60ab578.42±6.90ab注:a与对照组比较，p<0.05;b与应激组相比，p<0.05。2.2血清D-乳酸和DAO浓度的变化与对照组相比，应激组及低聚木糖+应激组血清D-乳酸、DAO浓度均明显增高（P<0.05）；与应激组相比，低聚木糖+应激组的血清D-乳酸、DAO浓度又显著降低（p<0.05）;对照组与低聚木糖组间两指标的差异无统计学意义（p>0.05)。（见9 青岛大学硕士学位论文表2.2）表2.2各组大鼠血清D-乳酸、二胺氧化酶检测数值比较（n=10）项目正常对照组低聚木糖组应激组低聚木糖+应激组D-乳酸(µg/L)1188.3±51.21190.5±24.7b1436.7±63.1a1306.2±27.6abDAO（pg/ml)4083.0±293.54261.9±379.6b6422.5±491.6a5323.8±419.9ab注:a与对照组比较，p<0.05;b与应激组相比，p<0.05。2.3相关性检测应激组和低聚木糖+应激组大鼠血清D-乳酸和DAO的含量升高，D-乳酸水平和DAO水平呈正相关（r=0.729，P<0.05)。2.4低聚木糖对应激大鼠肠道SIgA含量的影响从图2.3中可见，应激组肠道SIgA含量较正常对照组显著减少（p<0.05）；添加低聚木糖组比正常对照组显著增加（p<0.05）；低聚木糖+应激组肠道SIgA含量比10 第二章结果应激组明显提高（p<0.05）。图2.3各组大鼠肠道SIgA含量比较注:a与对照组比较，p<0.05;b与应激组相比，p<0.05。11 第三章讨论第三章讨论正常的肠粘膜屏障包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障以及微生态屏障，这四个屏障不仅影响人体的消化和吸收，而且在保护机体免受较强刺激、病原体入侵中具有重要作用。严重的疾病和创伤(脓毒血症、烧伤、休克等）常导致肠屏障功能受损，肠粘膜通透性增加，促使菌群移位，肠源性感染发生，通过一些列级联反应可最终导致全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭[5]。慢性应激与胃肠道疾病的关系密切相关[6]；应激时由于兴奋交感神经，引起机体内脏血管收缩，使胃肠道血流量减少，从而导致胃肠道功能受损。Matsuo等[7]研究发现束缚应激时小鼠血浆中糖皮质激素浓度升高，降低了上皮紧密连接完整性，导致肠道通透性改变。束缚应激对肠道的变化表现为肠粘膜结构不完整，充血水肿，上皮细胞间连接断裂，细胞凋亡，溃疡，伴淋巴细胞增多及中性粒细胞浸润，间质充血水肿，部分固有腺体消失等改变。应激状态下肠道机械屏障受损导致肠黏膜通透性增高，肠内菌群可通过受损黏膜上皮进入其他组织，引起细菌易位[8]。细菌易位会改变肠内菌群比例，破坏微生态系统平衡，各种肠内菌群产生大量致病物质，引起肠屏障损伤及炎性反应。肠道免疫屏障功能也遭到破坏，肠壁组织免疫细胞尤其是产sIgA的浆细胞，其数量减少及功能受抑制，生成的sIgA含量会减少，T淋巴细胞功能受到抑制，导致肠黏膜特异性抗感染能力降低；此时杯状细胞的功能受到破坏，生成的黏膜蛋白减少，致使肠黏膜非特异性屏障功能下降，从而机体全身抗感染防御功能遭到削弱[9]。DAO是具有高度活性的细胞內酶，广泛分布于人类和所有哺乳动物的肠粘膜细胞胞浆中[10]，当肠粘膜上皮细胞受损、坏死后DAO便释放入血，以致血液中DAO活性升高。Xu等[11]研究表明，低压缺氧环境造成大鼠肠粘膜损伤时伴有血DAO水平升高，应用谷氨酰胺营养减轻肠粘膜损伤的同时血中DAO水平也明显降低。Zhou等[12]发现在大鼠结膜炎模型中，肠粘膜受到损伤时，血中DAO水平升高，而且血DAO水平与受损程度相关。D-LAC是细菌发酵时产生的代谢产物，正常情况下，极少存在于血液中，而且哺乳动物没有特异酶系统将其快速降解。当发生全身感染、严重创伤或肠道疾病时，肠粘膜通透性增加，肠道细菌产生大量D-LAC经受损黏膜入血，致使其血中水平升高。Guzman-de等[13]研究表明，在大鼠肠道缺血再灌注模型中，血浆D-LAC浓度的变化与肠道组织病理损伤程度相一致，提示D-LAC是反应肠道通透性的一个良好指标。本实验结果显示，接受电刺激束缚大鼠血清中D-LAC水平、DAO活性显著低于正常对照组、低聚木糖组，说明模型组大鼠肠粘膜通透性增加和肠屏障受损。益生元是一种膳食补充剂，特别是低聚糖类益生元，可以通过促进肠道益生菌的生长,来使肠内菌群恢复平衡，同时还可以改善肠壁的通透性增加，提高了肠道的12 青岛大学硕士学位论文免疫能力，保护了肠黏膜屏障功能的正常进行。益生元的杰出代表—低聚木糖（Xylo-oligoosaccharides),是由2~7个木糖分子以β-1,4糖苷键合成的功能性聚合糖，具有对热、酸、酶很好的稳定性；在pH值为2．5～6．5酸性条件下．即使在121℃下持续30分钟以上也不会发生降解，是目前所有低聚木糖中性能最稳定的益菌因子。人体肠道中的双歧杆菌能分泌D-木糖苷酶，它可将低聚木糖水解成木糖，从而被双歧杆菌所利用；其增殖双歧杆菌的作用是其他同类低聚糖的5~20倍，现又被誉为“超强双歧因子”，具有很强的增殖双歧杆菌的功效，且增殖双歧杆菌的选择性很高，而有害菌体不能分泌该酶．故难以将其利用，因此低聚木糖对双歧杆菌具有很强的专一性增殖功能。益生元是一类能促进益生菌生长繁殖的物质，其不能直接对机体起到作用，而是通过益生菌发挥生理功能，可能通过以下机制来维护肠屏障功能[14]：(1)它可以刺激肠道内有益菌的生长和繁殖（尤其是双歧杆菌和乳酸杆菌），增加有益菌在肠内定植的抗力，抑制有害菌群的生长和繁殖，保持肠道内菌群相对的稳定；(2)既可刺激肠道内相关淋巴组织的生理活性也可促使免疫物质的生成，从而增强肠道的免疫功能；(3)它还可以增强机体的单核吞噬细胞的活性，提高宿主非特异性和特异性抗炎症反应能力；(4)为肠上皮细胞生命活动提供能量和营养，利于肠上皮细胞代谢和再生，促使肠屏障功能恢复。段云等[15]在急进高原缺氧Wistar大鼠试验中给予低聚半乳糖，观察对大鼠肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的影响，结果发现益生元可以增加高原缺氧大鼠肠黏膜紧密连接蛋白Occludin的表达，改善高原缺氧大鼠的肠黏膜屏障。其作用机制可能通过选择性得促进肠内有益菌群的生长，使高原缺氧造成的菌态失衡予以纠正，从而降低了肠上皮细胞能量的消耗。周景欣等[16]研究发现低聚木糖、低聚果糖、水苏糖等益生元能促使双歧杆菌和乳杆菌的增殖，并酸化肠道PH值，增加肠道中有益菌所占比例，有助于维持肠道微生态的平稳。王慧等[17]研究发现早期给予添加益生元的微生态EN有助于保护重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠屏障功能，降低内毒素易位的发生。本实验结果显示，低聚木糖+应激组大鼠血清D-LAC水平和DAO活性显著低于应激组，而高于正常对照组，提示低聚木糖虽不能完全逆转应激时肠道屏障的损伤，但可以在一定程度上减轻肠粘膜的受损，从而起到了维护肠粘膜屏障功能。低聚木糖具有选择性刺激肠道中双歧杆菌的生长，并能增强其活性，双歧杆菌可缓解应激大鼠肠道细菌移位、肠道通透性改变等现象从而调节肠道微生物菌群，发挥微生态屏障作用。研究报道[18-19]益生菌可以抑制肠道通透性增高和降低内脏器官高敏性，从而减缓肠道对应激的黏膜反应强度，降低应激诱导的肠道通透性增高。益生菌可使肠黏膜上皮细胞存活性增强、屏障作用和细胞保护反应得到改善，肠上皮细胞得以稳定[20]。研究[21-22]发现双歧杆菌在急性胰腺炎（AP）、伪膜性肠炎、烧伤等疾病中可保护肠道屏障功能，降低细菌易位，从而减少肠源性感染发生几率。ScholtersPA等[23]研究表明双歧杆菌促进免13 第三章讨论疫功能的作用与肠道SIgA分泌有关。SIgA在肠道内可发挥中和毒素、抵抗蛋白溶解酶、抑制有害细菌增殖等作用，通过诱导肠道免疫活性细胞到达免疫效应部位产[24］生免疫功能，SIgA是肠黏膜免疫屏障的主要成分。当免疫应答发生时，肠道相关淋巴组织便产生大量SIgA，其含量变化能反映出肠黏膜局部的免疫状态[25]。本研究发现，与正常对照组比较，低聚木糖组大鼠绒毛宽度、腺隐窝深度及粘膜厚度均得到明显改善（p<0.05)，肠液中SIgA含量明显增加；低聚木糖+应激组在肠粘膜结构、SIgA含量上与应激组有明显统计学意义（P<0.05）。14 第四章结语第四章结语上述研究中，发现接受应激的大鼠肠粘膜屏障受到了损伤，但给予低聚木糖应激组受损程度明显比单纯应激组轻，从而给我们提示大鼠饮食中添加低聚木糖，可在一定程度上降低应激时肠粘膜通透性增加，改善肠粘膜结构和功能，从而起到保护肠道屏障功能的目的。这为临床患者使用低聚木糖预防肠道疾病提供了基础理论依据和治疗指导，但低聚木糖对肠道粘膜保护作用的分子机制还需要更深入的研究。15 参考文献参考文献[1]张小爱.低聚木糖的生产及应用研究进展[J].中国食品添加剂,2009,(zl)：261-266.[2]徐勇,余世袁等.培养条件对低聚木糖增殖青春双歧杆菌的影响[J].林产化学与工业.2001,21(3):34-35.[3]KonturekPC,BrzozowskiT,KonturekSJ.Stressandthegut:pathophysiology,clinicalconsequences,diagnosticapproachandtreatmentoptions[J].JPhysiolPharmacol,2011,62:591-599.[4]王玉玉,张军等.双歧杆菌、醋酸梭菌及谷氨酰胺对慢性应激模型小鼠肠粘膜屏障的影响[J].郑州大学学报2014,49(2):153-156.[5]DingLA,LiJS,LiYS,etal.Intestinalbarrierdamagecausedbytraumaandlipopolysaccharide[J].WorldGastroenterol,2010,10（16）：2373-2378.[6]COLLINSSM.Stressandthegastrointestina1tractIV.Modulationofintestina1inflammationbystress:basicmechanismsandclinicalrelevance[J]AmJPhysiol,200l,280:315-318.[7]MatsuoK,ZhangX,OnoY,eta1．Acutestress-inducedcolonictissueHSP70expressionrequireseommensalbacterialcomponentsandintrinsicglucocorticoid[J]．BrainBehavImmun,2009,23(1)：108～115．[8]BerkeSJ,ViswanathanVK,SavkovicSD,etal.Intestinalepithelialresponsestoentericpathogens:effectsonthetightjunctionbarrier,iontransport,andinflammation［J］Gut,2003,52(3):439-451．[9]王浩,昊国豪,周昭彦等.不同营养方式对肠道缺血-再灌注大鼠肠屏障功能影响的实验研究［J］.肠外与肠内营养,2004,11(1):31-35．[10]CakmazR,BtiyfikaslkO,KahramansoyN,eta1．AcombinationofplasmaDAOandcitrullinelevelsasapotentialmarkerforacutemesenterieisehemia[J]．LibyanJMed,2013,8：l-6.[11]XuCL,SunR,QiaoXJ,etal.Protectiveeffectofglutamineonintestinalinjuryandbacterialcommunityinratsexposedtohypobarichypoxiaenvironment[J].WorldJGastroenterol,2014,20(16):4662-4674.[12]Zhou,S,XuCD,ChenSN,eta1．Correlationofintestinalmucosalinjurywithserumdiamineoxidase[J]．ZhonghHaErKeZaZhi,2006,44(2)：93—95．[13]Guzman-deLGF,Ibarra-HernándezJM,Cordero-PérezP,etal．Temporalrelationshipofserummarkersandtissuedamageduringacuteintestinalischemia/reperfusion[J]．Clinics(SaoPaulo),2013,68(7)：1034—1038．[14]OuwehandAC,DerrienM,deVosW,eta1．Prebioticsandothermicrobialsubstratesforgutfunctionality．CurrOpinBiotechnol,2005,16：212-217．[15]段云,张方信,单体栋,等．添加益生元对急进高原大鼠肠黏膜屏障紧密连接蛋白Occludin的16 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综述综述低聚木糖对应激肠黏膜屏障功能的影响摘要应激会引起机体消化系统发生一系列的病理生理改变，其发生机制十分复杂，肠黏膜屏障功能受损往往由于肠道的机械、化学、免疫或微生物屏障的破坏。能及时诊断、评价肠黏膜功能损伤对机体具有重要意义，本文介绍血内毒素、D-乳酸及血二胺氧化酶（DAO)作为检测肠功能改变的血清学指标。低聚木糖作为益生元的代表，改变肠内菌群结构，抑制病原菌过度繁殖，减少肠道细菌移位，促进肠上皮细胞增生，维持肠黏膜结构和功能恒定，对改善肠道屏障功能有一定作用。关键词：应激；肠屏障；益生元；低聚木糖一.应激与肠粘膜屏障随着生活节奏逐步加快及各方面竞争压力不断增加，心理应激正威胁着人类的健康。应激性生活事件被认为与消化系统最常见疾病的发病或症状加重相关,包括功能性胃肠道疾病(FGID)、胃食管反流病(GERD)、炎症性肠病(IBD)和消化性溃疡病(PU)等等。临床试验研究证明:急性和慢性应激可以引起肠道显著的病理生理改变[1]。应激引起肠道功能障碍致病或复发的机制仍不清楚,但是有一个比较可能的机制:肠粘膜屏障功能的障碍[1]。机体的肠黏膜的屏障是由四部分来构成,一是由肠上皮细胞的胞间紧密连接和黏液层构成的粘膜机械屏障;二是由肠道内正常的菌群及其代谢产物所构成的生物学屏障：三主要是由肠相关淋巴结和肠粘膜淋巴小结分泌的sIgA构成的免疫学屏障[2-3]；四是由胃肠道分泌的胃酸、消化酶、粘多糖、溶菌酶、抗菌肽等化学物质构成化学屏障。一般情况下,由于机体的肠壁具有完整的屏障功能,可以把肠内的有害菌和内毒素等物质局限在肠腔内，而不会经肠壁转移到外周的脏器。肠道粘膜的屏障功能主要由肠道的粘膜上皮层维持：上皮细胞层和顶端的紧密连接的完整,限制了有害分子的跨膜扩散,一起构成了肠道黏膜屏障。这个屏障并不是固定不变的,而是受到神经内分泌和免疫因子等神经体液的调节,因此可能是应激的靶点。1.应激对肠粘膜机械屏障的影响：在应激状态下机体会有出现血流的重新分配、经胃肠道的血流量明显减少等现象。较与其它器官胃肠道发生缺血缺氧时间早，得到恢复却又最迟[4]。但是由于缺血缺氧可直接引起肠黏膜上皮细胞的水肿，引起上皮细胞间正常连接的断裂，使细胞非自然坏死、形成轻重不一的溃疡，还增加了肠黏膜的通透性。细胞凋亡是应激除在肠粘膜上皮细胞造成损伤破坏之外的另一种方式。18 青岛大学硕士学位论文应激也可导致肠道黏膜的缺血以及再灌注损伤，缺血缺氧状态导致肠道黏膜屏障功能受损，与此同时再灌注后的肠壁也会受到其产生的活性氧自由基、NO及其他炎症介质的进一步损伤，影响肠黏膜修复[5]。应激可改变肠上皮细胞的分化，ZO-2和咬合蛋白mRNA的表达减少致使肠屏障功能障碍；烧伤休克期肠道通透性增加的同时，肠上皮细胞连接处的ZO-1和咬合蛋白减少并且重新排布，紧密连接蛋白结构改变，可能是烧伤后早期缺血缺氧时肠道屏障发生功能障碍的重要机制之一。胃肠的运动功能在肠道屏障功能中也起到重要的作用，其主要受来自肠内神经系统所分泌的循环及局部激素神经递质的调节。如胆囊收缩素、血管活性肠多肽、降钙素基因相关肽的调节。创伤、寒冷、疼痛等应激时可诱导上述神经递质的释放从而抑制小肠的运动，导致细菌在邻近肠黏膜停留的时间延长，便增加了细菌易位机会。2.应激对肠道内微生物屏障的影响：在应激状态下肠道的机械屏障的受损将直接导致肠黏膜的通透性明显提高，肠道内的菌群便可通过这些受损的黏膜上皮细胞进入到机体的其他组织，这便造成了细菌的易位[6]。细菌易位将会直接改变肠道内各类菌群所占比例，破坏了微生态系统的平衡，各种肠道内菌群会产生大量的致病物质，引起了肠屏障损伤和炎性反应。肠内病原体可通过与肠道细胞表面分子直接结合从而改变胞间紧密连接蛋白的表达导致肠黏膜屏障损伤，或者，肠道内的病原体产生的内毒素和蛋白酶可促进细胞损伤及凋亡，并且破化胞间紧密连接及胞内骨架，从而导致肠黏膜屏障的损伤。3.肠道的免疫防御系统被认为是阻止外来细菌入侵的第［7］一道防线，肠道相关淋巴组织和细胞产生并分泌sIgA在肠道起到重要的免疫功能外，也具有保持消化道上皮的完整性，使消化道能够进行正常的消化吸收功能，维持机体营养方面的作用。应激时，肠道免疫屏障功能也遭到破坏，肠壁组织免疫细胞尤其是产sIgA的浆细胞，其数量减少及功能受抑制，细胞生成的sIgA含量会减少，T淋巴细胞的功能便遭到了抑制，导致肠黏膜特异性抗感染能力降低；此时杯状细胞的功能受到破坏，生成的黏膜蛋白减少，这就致使肠黏膜非特异性的屏障功能有所下降，从而机体全身抗感染防御功能遭到削弱[8]。应激时流经肠道、腹腔内脏器官的血流量减少，此时肠壁固有层中浆细胞的数量及质量下降，IgA单体受到影响，分泌量减少，加工处理IgA双体和组配sIgA能力也会受到影响，合成量降低，同时因为经肝血流量的减少，降低了肝脏细胞对IgA单体加工修饰成IgA双体和sIgA的组配能力，经胆汁分泌的sIgA进入肠腔的量减少，以致严重削弱了肠道免疫屏障功能。4.应激对肠壁化学屏障的影响：在严重感染、烧伤等应激下机体由于禁食，胃肠道便会处在无负荷状态，食物的减少，消化系统激素刺激削弱，降低了胃肠道黏膜细胞组织更新修复的能力，进一步减少了胃液、胆汁、黏多糖、溶菌酶等抑菌物质分泌，消化液杀菌能力减弱；破坏了肠道化学屏障功能，此时细菌易位、内毒素血症等病症也会因外籍菌得到优势繁殖而出现，进一步损坏肠屏障功19 综述能及发生全身炎症反应综合。二.肠黏膜屏障功能血清学相关检测目前对诊断肠黏膜屏障功能障碍重要指标是肠黏膜屏障功能的血清检验学检测。1.血内毒素内毒素是革兰阴性杆菌细胞壁-脂多糖(LPS)成分,正常情况下机体肠腔内含有大量等有害物质（如：细菌、内毒素等）。当肠屏障功能障碍时,内毒素及有害分子可穿过肠黏膜,进入血液循环,形成全身机体的内毒素血症。肠黏膜屏障功能受损程度可以经外周血中内毒素水平监测。研究证实内毒素入血后促进肝脏合成内毒素结合蛋白,LBP能促进LPS与CD14结合。对肝硬化患者,血清LBP测定是检测细菌移位简单可行的方法。黎沾良[9]实验中发现更容易穿过破损的黏膜屏障的物质是内毒素，因其分子量更小,在严重创伤、烧伤、大手术、休克等应激状态下内毒素血症往往先出现,细菌移位随后发生。血中内毒素水平升高通常加重了肠屏障功能的损害，如此这样，便形成恶性的循环。早期肠屏障损伤导致的内毒素移位可通过测定血内毒素含量来判断,但不能鉴别革兰氏阴性菌的种类,各种抗生素诱导的菌体释放出内毒素水平各不相同,自然而然的影响了检测的准确性，进而影响了肠黏膜屏障的损伤程度的判定和评价,致使本次治疗的指导意义受到了限致[10]。2.血D-乳酸D-乳酸是细菌发酵时产生的代谢产物，正常情况下，极少存在于血液中，而且哺乳动物没有特异酶系统将其快速降解。当发生全身感染、严重创伤或肠道疾病时，肠粘膜通透性增加，肠道细菌产生大量D-LAC经受损黏膜入血，致使其血中水平升高。故监测其血中含量能及时反映肠黏膜损害程度及通透性改变[11]。刘等[12]在他的实验中采用大鼠的动脉夹夹闭大鼠的肠系膜上动脉制成肠缺血一再灌注模型,等到肠缺血45min的时候,血D-乳酸的水平有了明显的增加;再等到肠缺血再灌注2h时,D-乳酸的含量又达到了峰值,D-乳酸的水平与肠黏膜损伤程度出现了明显的正相关关系。临床研究表明肠系膜缺血患者血清中D-乳酸水平比其他肠道疾病显著增高[13]，因此D-乳酸水平可作为急性肠系膜缺血诊断的重要标志物之一。临床上检测肠道的功能改变相对较好的指标便是D-乳酸,因其标本采集比较方便,通过检测其数值的动态上的变化,并排除其他因素的干扰，便能更好得反映出肠黏膜屏障功能上发生的改变[11]。3.血二胺氧化酶二胺氧化酶(diamineoxidase,DAO)是存在于细胞内具有高度酶活性的蛋白质，在人类和所有的哺乳动物的肠黏膜上的细胞胞浆中含量甚高，尤其是在空、回肠内，当肠粘膜上皮细胞受损、坏死后DAO便释放入血，以致血液中DAO活性升高[14]；它也会随坏死的脱落的肠黏膜上皮细胞一同进入肠腔内,升高了肠腔内DAO含量。因DAO在外周血中较稳定的存在着,所以通过测定它在外周血中活性的改变,就可反映肠黏膜当时的状态,其中它主要反映的便是20 青岛大学硕士学位论文肠黏膜的上皮损伤与修复的情况。临床试验上也证明了血浆DAO活性变化是反应肠黏膜受损程度的早期诊断的敏感指标[15],Xu等[16]研究表明，低压缺氧环境造成大鼠肠粘膜损伤时伴有血DAO水平升高，应用谷氨酰胺营养减轻肠粘膜损伤的同时血中DAO水平也明显降低。Zhou等[17]发现在大鼠结膜炎模型中，肠粘膜受到损伤时，血中DAO水平升高，而且血DAO水平与受损程度相关。在实验中已发现新生儿胃肠功能的障碍诊断的特异性更高的是血D-乳酸水平的变化,但仍不及血中的DAO敏感[18]。三.益生元-低聚木糖对肠屏障的保护作用应激与焦虑近些年来被认为是许多消化系统疾病的一种病因学因素。肠粘膜屏障功能弱化而引发的肠腔内各种细菌、毒素等大分子物质进入体内是炎症性胃肠疾病发生和进一步恶化的关键性起始因素[19]。由此看来,改善肠道的屏障功能可能是预防或者改善应激诱导的肠道功能障碍的新方案与新对策,因此如何维持和保护患者肠黏膜屏障功能是目前临床研究的一个重点和热点问题。加强肠道的屏障功能可能是预防和改善应激诱导肠屏障障碍的新对策,早期有关于肠粘膜屏障保护作用的研究方向主要聚焦在谷氨酞胺[20-21]、生长激素[22-23]、精氨酸[24]等等，但相关的研究未取得明显的进展。近些年来随着微生态学理论的不断发展,微生态对于肠屏障功能以及全身免疫功能的保护作用受到越来越多的关注。益生元的概念最早由Gibson等(1995年)[25]提出来，益生元是一种膳食补充剂，特别是低聚糖类益生元，可以通过促进肠道益生菌的生长,来使肠内菌群恢复平衡，同时还可以改善肠壁的通透性增加，提高了肠道的免疫能力，保护了肠黏膜屏障功能的正常进行[26-27]。益生元的杰出代表—低聚木糖（Xylo-oligoosaccharides),是由2~7个木糖分子以β-1,4糖苷键合成的功能性聚合糖，具有对热、酸、酶很好的稳定性；在pH值为2．5～6．5酸性条件下．即使在121℃下持续30分钟以上也不会发生降解，是目前所有低聚木糖中性能最稳定的益菌因子。人体肠道中的双歧杆菌能分泌D-木糖苷酶，它可将低聚木糖水解成木糖，从而被双歧杆菌所利用；其增殖双歧杆菌的作用是其他同类低聚糖的5~20倍，现又被誉为“超强双歧因子”[28]，具有很强的增殖双歧杆菌的功效，且增殖双歧杆菌的选择性很高[29]，而有害菌体不能分泌该酶．故难以将其利用，因此低聚木糖对双歧杆菌具有很强的专一性增殖功能。人体消化道内所产生的酶类不能水解β-1,4糖苷键，因此它很容易通过人体胃部的酸性环境和肠道而不被破坏直接进入肠内为双歧杆菌优先利用，通过促进有益菌株的生长繁殖，减少体内代谢及有害菌株产生的有害物质，起到净化血液、清除体内毒素、减轻肝脏负荷并保护肝脏的目的。另外还有研究报道低聚木糖具有增强机体免疫、抗肿瘤等方面作用。益生元是一类能促进21 综述益生菌生长繁殖的物质，其不能直接对机体起到作用，而是通过益生菌发挥生理功能，可能通过以下机制来维护肠屏障功能[30]：(1)通过对肠道中有益菌的刺激让其良好的生长繁殖（主要是双歧杆菌和乳酸杆菌），提高它们在肠内定植生活的抵抗抗力，进而抑制了有害的菌群的不良增殖，保持了肠道中菌群系统的平衡；(2)通过刺激肠道的淋巴组织的功能活性，促使免疫物质的生成，增强了肠道的免疫功能；(3)通过增强机体的吞噬细胞的活性，提高宿主的非特异性和特异性免疫活性调节的能力；(4)为肠道的上皮细胞生命活动提供能量和营养，利于肠上皮细胞代谢和再生，促使肠屏障功能恢复。段云等[31]在急进高原缺氧Wistar大鼠试验中给予低聚半乳糖，观察对大鼠肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的影响，结果发现益生元可以增加高原缺氧大鼠肠黏膜紧密连接蛋白Occludin的表达，改善高原缺氧大鼠的肠黏膜屏障。其作用机制可能通过选择性得促进肠内有益菌群的生长，使高原缺氧造成的菌态失衡予以纠正，从而降低了肠上皮细胞能量的消耗。临床上研究[32]也显示，益生元在肠内具有的竞争排他作用对肠源性细菌感染性疾病以及菌群稳态失衡有一定的预防作用。Qin等[33]对76例急性胰腺炎患者采用天然免疫营养治疗，发现天然免疫营养组在营养状态和肠黏膜通透性上比普通肠内营养对照组改善得更为明显，并且肠源性感染的发生率也明显降低。周等[34]的研究里表明低聚木糖、低聚果糖、水苏糖等益生元能够起到促进双歧杆菌和乳杆菌的生长增殖，并酸化肠道降低肠道的PH值，增加肠道里的有益菌群所占的比例的作用，有助于维持肠道微生态的平稳。王慧等[35]研究发现早期给予添加益生元的微生态EN有助于保护重症急性胰腺炎（SAP）大鼠肠屏障功能，降低内毒素易位的发生。本实验结果显示，低聚木糖+应激组大鼠血清D-LAC水平和DAO活性显著低于应激组，而比正常对照组高，这提示了低聚木糖虽然不能完全的逆转应激时大鼠肠道屏障的伤害，但是它在减轻肠粘膜的受损上起了很大保护作用，从而在一定水平上维护肠粘膜屏障功能。低聚木糖具有选择性刺激肠道中双歧杆菌的生长，并能增强其活性，双歧杆菌可缓解应激大鼠肠道细菌移位、肠道通透性改变等现象从而调节肠道微生物菌群，发挥微生态屏障作用。研究报道[36-37]益生菌可以抑制肠道通透性增高和降低内脏器官高敏性，从而减缓肠道对应激的黏膜反应强度，降低应激诱导的肠道通透性增高。益生菌不但能够增强肠黏膜的上皮细胞的存活性，也提高其屏障作用和细胞保护反应的强度，使得肠上皮细胞稳定[38]。研究[39-40]发现双歧杆菌在急性胰腺炎（AP）、伪膜性肠炎、烧伤等疾病中可保护肠道屏障功能，使细菌不易易位，起到减少肠源性感染发生几率的作用。进一步相关的研究表明，对于体内双歧杆菌水平较低的个体，比如老年人、患有胃肠道疾病病人，添加益生元产生的效果更显著[41]。已有证据表明，老年人肠道微生物群的种类与数量与年轻人有很大的不同，特别是双歧杆菌的数量呈明显的下降，可能与老年人饮食结构的改变，抗生素的应用和肠道受体位置的变化有关，因此加22 青岛大学硕士学位论文大了老年人患病的危险因素。许多研究者认为随着年龄增加而肠道中的双歧杆菌数量的下降可以通过增加益生元的摄入来改善。65～80岁老年人服用低聚乳糖的的结果表明，低聚乳糖能增加双歧杆菌数量增加吞噬作用，增加NK细胞的活性，增加IL-10细胞因子的水平，而减少促炎症细胞因子水平。ScholtersPA等[42]研究表明双歧杆菌促进免疫功能的作用与肠道SIgA分泌有关。sIgA在肠道内可发挥中和毒素、抵抗蛋白溶解酶、抑制有害细菌增殖等作用，通过诱导肠道免疫活性细胞到［43］达免疫效应部位产生免疫功能，sIgA是肠黏膜免疫屏障的主要成分。当免疫应答发生时，肠道相关淋巴组织便产生大量sIgA，其含量变化能反映出肠黏膜局部的免疫状态[44]。李等通过实验发现，魔芋甘露低聚糖既能够促进小鼠机体细胞的免疫功能也可以增强小鼠机体单核巨噬细胞的吞噬能力[45]；地黄低聚糖可以提高那些免疫受到了抑制的小鼠的淋巴细胞的恢复产生抗体的能力，而且还可以促进小鼠骨髓粒单细胞的免疫功能[46]。总上所述，应激致使肠道屏障功能损伤机制涉及到了免疫、分子生物学及微生物等各个学科领域，是一个相当复杂的反应机制，具体的机制调节仍然需更加深刻的探讨和进一步实验研究。关键所在便是要选择恰当的检测指标,建立出更加正确有效的监测机制以及及时地判断患者是否具有无肠黏膜损伤；一般比较常用的方法便是监测血内毒素、D-乳酸和DAO的含量,但它们各有各的缺陷,因此高效精准的检测技术是非常必要的。对于改良肠道内的菌群结构、维持肠道的微生物群系的生态平衡、改善肠黏膜的结构和功能益生元起到了重要的作用。益生元对于保持和调理肠道内环境的健康具有重要意义，因此其应用价值及发展前景非常广阔。23 参考文献参考文献[1]CameronHL,PerdueMH,etal.StressImPairsMurineIntestinalBarrierFunetion:ImProvementbyGlueagon-LikePePtide-2.JPharmaeolExPTher.2005Jul;314(l):214-20.[2]SakbawatHR,MichaelJM.Intestinalhypoperfusioncontributestogutbarrierfailureinsev-Ereacutepanereatitis[J].JGastrointestSurg,2003,7:26-36.[3]段建华,晏春根.肠粘膜屏障研究进展[J].实用医学杂志,2o04,20(2):212-214.[4]SECCHIA，ORTANDERLJM，SCHMIDTW，etal．Effectofendotoxemiaonhepaticportalandsinusoidalbloodflowinrats［J］．JSurgRes，2000，89(1):26-30．[5]JACOBC，YANGPC，DARMOULD，etal．Mastcelltryptasecontrolsparacellularpermeabilityoftheintestine.Roleofprotease-activatedreceptor2andbeta-arrestins［J］．JBiolChem，2005，280(36):31936-31948．[6]SakbawatHR,MichaelJM.Intestinalhypoperfusioncontributestogutbarrierfailureinsev-Ereacutepanereatitis[J].JGastrointestSurg,2003,7:26-36.[7]REILLYPM，WILKINSKB，FUHKC，etal．Themesenterichemodynamicresponsetocirculatoryshock:anoverview［J］．Shock，2001，15(5):329-343．[8]段建华,晏春根.肠粘膜屏障研究进展[J].实用医学杂志,2004,20(2):212-214.[9]黎沾良.肠道细菌移位和外科重症[J].中华外科杂志,1998,12(36):11-12.[10]李云玖,马恩陵,张立阳.实时定量PCR在细菌移位研究中的潜力[J].中国临床营养杂志,2006,14(2):122-126.[11]蔡元坤,秦新裕.D-乳酸与肠道屏障功能[J].国外医学:外科学分册,2004,31(6):331-335.[12]刘枚林,张嘉,刘瑞林等.肠脂肪酸结合蛋白和D-乳酸早期诊断肠缺血一再灌注损害的实验研究[J].中华创伤杂志,2006,22(10):767-770.[13]NielsenC，MortensenFV，ErlandsenEJ，etal.L-andD-lactateasbiomarkersofarterial-inducedintestinalischemia:anexperimentalstudyinpigsJ.IntJSurg，2012;10(6):296-300.[14]CakmazR，BtiyfikaslkO，KahramansoyN，eta1．AcombinationofplasmaDAOandcitrullinelevelsasapotentialmarkerforacutemesenterieisehemia[J]．LibyanJMed，2013，8：l-6.24 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致谢致谢首先，我要衷心的感谢我的导师丁连安教授。丁连安老师不仅学识渊博，专业知识强硬，对于实验操作更是精益求精。在导师那里，我学会的不单单是专业知识理论，更是对待科学求真务实，脚踏实际的态度。导师为人严谨的教育品质和一丝不苟的科学实验理念更将会使我受益一生。此外，还要衷心地感谢青岛大学附属医院普外科的各位老师和青岛大学西校区动物实验室的各位老师同学在我实验期间对我的支持与帮助。在这里，我要致上最真诚的祝福感谢所有帮助过我的老师和同学！29 30