棉花草甘膦自然抗性评价及抗性基因源挖掘研究

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1、乂.‘.'""Vi.-_編應dentificationofNaturalResistanceto-一藝=着麵博士H冬王_指导教师:王坤波研究员申请職类别:农学博士攀麵，:mYI密级:论文编号:中国农业科学院学位论文棉花草甘膦自然抗性评价及抗性基因源挖掘研究IdentificationofNaturalResistancetoGlyphosateinGossypiumandtheExcavationofGlyphosate-resistantGeneResourcesinGossypiumhirsutumRaces博士研

2、究生：王园园指导教师：王坤波研究员申请学位类别：农学博士专业：作物种质资源学研究方向：基因挖掘与功能验证培养单位：中国农业科学院棉花研究所中国农业科学院研究生院2015年3月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationIdentificationofNaturalResistancetoGlyphosateinGossypiumandtheExcavationofGlyphosate-resistantGeneResourcesinGossypi

3、umhirsutumRacesPh.D.Candidate：WangYuanyuanSupervisor：Prof.WangKunboMajor：CropGermplasmSpecialty:GeneExcavationandFunctionVerificationMarch2015III摘要自1940年第一例除草剂2,4-D问世至今，不断出现各种作用机制的除草剂，目前种类繁多。1974年商业化的草甘膦具有广谱、灭生性，杀草能力强，副作用小，在除草剂中独树一帜，且在全世界范围内被广泛使用。发展转基因抗草甘膦作物很大程度

4、上方便了草甘膦除草，但存在转基因安全隐患。因此，在植棉过程中，从现有棉花资源挖掘内源抗草甘膦基因源，并用于棉花育种，可有效解决诸多问题。棉花种质资源蕴含许多优异基因，鉴于此，本文旨在对野生棉、半野生棉和亚洲棉种质材料草甘膦自然抗性进行鉴定和评价，分析半野生棉极端反应材料的epsps基因序列及其表达量，阐明抗性与epsps基因的关系，并通过全基因组关联分析方法，从数量性状思路挖掘棉花中抗草甘膦的基因源。研究结果如下：1.棉花种质材料草甘膦自然抗性评价及比较分析分别采用嫩枝喷洒法和棉花叶片棉球定位法，对26个野生棉种共13

5、4株和7个半野生棉种系共403份，及收集自5个地区的亚洲棉共101份材料，进行了草甘膦自然抗性的鉴定和评价，并对其抗性水平进行了比较分析。通过田间鉴定试验，获得了一个棉花除草剂自然抗性鉴定的方法，拟定了相应抗性水平的评价参考标准，并分别筛选出1份、2份和5份高抗的野生棉、半野生棉和亚洲棉材料，16份和1份高感的野生棉和半野生棉材料。分别以苗期、蕾期和花铃期常规栽培棉中棉所12的草甘膦致死浓度0.1%、0.15%和0.25%为标准，采用喷洒法对高抗和高感半野生棉材料进行田间抗性鉴定，最终得到稳定的抗和敏感材料各1份。同时

6、，比较分析发现鉴定材料抗性水平多样性依次是：野生棉>半野生棉>亚洲棉；鉴定材料的整体抗性水平依次是：亚洲棉>半野生棉>野生棉。对棉花种质资源的草甘膦抗性进行评价，有助于全面系统地了解棉花的草甘膦抗性，为研究棉花的草甘膦抗性机制及内源抗性基因源的挖掘奠定材料基础，同时也指导抗草甘膦棉花育种。2.半野生棉内源epsps基因序列及表达量分析以sad1基因为参考基因，采用孟山都公司转基因抗草甘膦棉花的基因序列特异引物，对半野生棉极端材料进行转基因成分检测，证明筛选出的极端材料不含转抗草甘膦基因成分。采用陆地棉（珂字棉312）中

7、epsps基因全长引物对半野生棉材料DNA进行扩增，扩增产物经测序并翻译成氨基酸序列，比对分析发现半野生棉epsps基因没有特异的氨基酸突变位点，说明半野生棉材料抗性的产生不是由epsps基因突变而致。对材料喷施0.2%的草甘膦溶液，48h后取样，采用RT-PCR方法检测epsps基因表达量变化，发现草甘膦处理后，epsps基因表达量无明显变化，这表明半野生棉草甘膦抗性可能不是由epsps基因引起，而是其它抗性机制而致，有待以新的思路去研究。3.关联分析方法挖掘半野生棉草甘膦抗性基因源2013年，在三个不同环境下，对2

8、02份半野生棉材料进行与草甘膦抗性相关表型的测定，包括莽草酸含量和地上部分相对干重，并与覆盖全基因组的182对SSR多态性标记的基因型数据进III行全基因组关联分析，共检测到72个与草甘膦抗性相关的位点，其中，48个和41个位点分别与莽草酸含量和地上部分相对干重显著相关。基于成功关联的SSR引物序列和中国农业科学院棉花研究所公布的