vero细胞无血清培养基的研制及其在流感病毒培养中的应用

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1、＇＊．．京诚和皆ｆ從中画钟《據硕±研究生学位论文Ｍ）化京协巧医学院研究生院中国医学科学院北京协巧医学院硕±学位论文学校代码：１００２３学号：硕±学位论文Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基的研制及其在流感病毒培养中的应用所院：医学生物学研究所姓名；段盼盼指导教师：李卫东研究员导师小组；马磊寸怡娜朱文勇学科专业：病原生物学研究方向：Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基完成日期．．；２０１５５２５中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文目录摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ３即胃５一第部分Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基的研制

2、１３１．实验材料１３１１１３．细胞株１．２细胞培养基１３１１．３细胞培养基添加成分３１．４实验试剂１３１１４．５主要仪器设备２１４．实验方法１１４２．种子细胞复苏２．２细胞传代１５２１５．３细胞无血清饥饿２１．４无血清培养基的优化５２．５无血清细胞冻存１６２．６分析方法１６２１．６．细胞形态学观察１６２１６．６．２细胞计数２．６．３长期稳定性实验１７２．６．４细胞生长曲线绘制１７－１２．６．５ＣＣＫ８法测定细胞增值７２／７统升学分析１８２１８．８无血清培养基优化设计２

3、１１．８．单因素实验９２Ｐ－．８．２ｌａ浊ｅｔｔＢｕｒｍａｎ实验设计１９１２乂３最陡爬坡实验２２．８．４中必组合实验２１２．９优化組合验证２２３．结果和分析２３３．１单因素实验２３－３ｌａｃｋｅＢｕｒｍａｎ实验结果２５．２Ｐｔ３如．３最陡爬坡实验结果３．４中也组合实验结果２８３．５优化组合的验证３１１３．６长期稳定性实验３３３３．７细胞生长曲线测定Ｗ３４小结３６７参考文献３第二部分Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基培养Ｈ５Ｎ１流感病毒４４１．实验材料４４Ｉ中国医学科学院北京协和医学院

4、硕±学位论文１．１病毒株４４１２４４．细胞株１．３主要仪器设备４４１．４实验试剂４５２．实验方法４５２．１流感病毒Ａ／Ａｎｈｕｉ／ｌ／２００５Ｖａ（Ｈ５Ｎ１）的扩増４５２．２流感病毒Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２００５Ｖａ（Ｈ５Ｎ１）的收获４６２．３ＭＯＩ的计算４６２．４病毒测定４６２．４．１感染性滴度测定（ＴＣＩＤ５０）４６２．４血凝值（ＨＡ）测定７．２病毒４２．５统计学分析４７．淵飾析３４７３１ＳＦＭ－．流感病毒感染Ｖｅｒｏ２０细胞的条件优化４７１ＴＰ－３丄ＣＫ族蛋白酶添加量的优化４７

5、３丄２－补加ＴＰＣＫ膀蛋白酶的影喃４９３丄３Ｍ０Ｉ的优化５０３．２兰种培养基中Ｖｅｒｏ细胞生产病毒情况对比５２论５５小结５７参考文献５８附录Ｉ缩略词表５９附录ＩＩ主要溶液及培养基配置６０谢６６个人简历６７独创性声明６８学位论文版权使用授权书的ＩＩ中国医学科学院北京协和医学院硕±学位论文Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基的研制及其在流感病毒培养中的应用摘要流行性感冒是人类至今不能有效控制的传染病之一，每次流行都给人类的健康和经济造成重大的损失。虽然有抗病毒药物，但可能诱导耐药株出现，不适合大范围长时间来

6、应对流行性感冒。目前接种疫苗仍被认为是预防流感的最好方法。传统的流感疫苗Ｗ鸡胚为培养基质，生产过程容易受到微生物的污染、不能大规模生产、对流感大流行应急能力差等，因此基于动物细胞为基质生产的流感疫苗成为疫苗发展的重要方向。非洲绿猴肾细胞系Ｖｅｒｏ是世界卫生组织ＷＨＯ推荐的人用疫苗生产基质，，目前己用于多种疫苗的生产其安全性已得到认证。在流感大流行时，如何ｌ提高细胞培养技术水平（ｉ提高流感疫苗的产量和生产效率及病毒的培养条件成为动物细胞大规模培养及疫苗生产的目标和竞争核也。动物细胞无血清培养基的开、发，将实现流感疫苗高效率低成本的生产，成为流感疫苗开发的重要环节。因此

7、，本文借助统计学方法开发适用于Ｖｅｒｏ细胞生长的无血清培养基。￣Ｐ－一一首先，本文通过连续运用单因素实验ｌａｃｋｅｔｔＢｕｒｍａｎ实验最陡爬坡实验中也组合实验５种统计学方法，建立了Ｖｅｒｏ细胞无血清培养基快速商效的开发技术。通过单因素实验设计确定了膜岛素、转铁蛋白、高密度脂蛋白、牛血清白蛋白、表皮生长因子、透明质酸和亚晒酸钢在后续实验中的添加浓度，考察的浓度范围分－－／ｍ