结核分枝杆菌rv3295蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

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1、分类号：Q813.2单位代码：10193密级：公开学号：2012659硕士学位论文结核分枝杆菌Rv3295蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位鉴定GenerationofaMonoclonalAntibodyagainstMycobacteriumtuberculosisRv3295proteinandCharacterizationofitsepitopes作者姓名：崔莹莹学位类别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：畜禽疫病防治指导教师：刘思国研究员所在学院：动物科学技术学院2015年5月独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人

2、在导师指导下，独立进行研究所取得的成果。尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。学位论文作者签名：签字日期：年月日关于学位论文使用授权的声明1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农

3、业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。学位论文作者签名：签字日期：年月日指导教师签名：签字日期：年月日摘要结核分枝杆菌作为结核病的病原微生物，

4、很早就引起了人们的关注，并对其进行过大量的研究。结核分枝杆菌内存在着数量众多的转录调控因子，组成庞大的基因调控网络及次级调控网络，调控着不同基因在不同生理条件下的表达水平，使菌体能够适应环境变化而维持正常代谢，从而可能成为药物设计的靶标。结核分枝杆菌中转录调控因子的作用目前研究的还不是很清楚，其中Rv3295蛋白隶属于TetR转录调控家族，TetR家族参与了细菌的新陈代谢，小分子物质的运输，抗生素的产生等多种生理过程，具有重要调控作用。本研究以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板，通过PCR扩增出683bp的rv3295基因

5、，经限制性内切酶NdeΙ和XhoΙ双酶切后，克隆至表达载体pET-22b中，构建pET22b-rv3295重组质粒,并将测序正确的阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。该重组蛋白在终浓度1mmol/LIPTG于30℃条件下诱导并获得了可溶性表达。经SDS-PAGE电泳分析呈现出了一个分子量为25ku的蛋白条带，与预期蛋白大小相符。并通过亲和层析纯化，获得较高纯度的Rv3295蛋白，然后经Western-Blot分析验证，结果表明成功表达了带有His标签的重组蛋白。以该重组蛋白为免疫原，免疫BALB/C小鼠，利用细胞

6、融合、克隆和筛选等技术，获得1株抗Rv3295重组蛋白的单克隆抗体Rv3295-1F7。采用Westernblot验证抗体的特异性，通过亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型，结果显示该抗体重链为IgG1，轻链为κ链，可用于后期对Rv3295蛋白功能及应用研究。应用噬菌体随机肽库对Rv3295-1F7单抗进行3轮生物淘选，得到25株阳性噬菌体。测序结果表明：6个噬菌体序列为LTIHMDNHGPHR，2个噬菌体序列为SWFGATGVGPHR。这分别与结核分枝杆菌Rv3295蛋白的氨基酸序列18-29位和107-119位氨基酸有一定的相似度。噬菌体竞

7、争抑制试验与ELISA方法证实，筛选出的噬菌体多肽的空间构像和天然抗原表位相似，可用于检测结核分枝杆菌及相关表位疫苗的研究。关键词：结核分枝杆菌，Rv3295，单克隆抗体，噬菌体展示技术，抗原表位鉴定IAbstractThepathogenicmicroorganismofMycobacteriumtuberculosisisaharmfulandseriousthreatforthehumanbeing.Ithasattractedscientists’attentionforalongtimeandalotofresearches

8、havebeendone.TherearelotsoftranscriptionalregulatorsinMycobacteriumtuberculosis.Largenetworkandsub-networkoftr