蓝氏贾第鞭毛虫包囊分化及逆境胁迫下sncrna的研究

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1、李岩中山大学博士学位论文2009年4月蓝氏贾第鞭毛虫包囊分化及逆境胁迫下sncRNA的研究专业：生物化学与分子生物学博士生：李岩指导教师：屈良鹄教授摘要DNA、RNA和蛋白质是组成生命的三大类基本物质。其中DNA是遗传信息的携带者，蛋白质是生物功能的行使者，而对于RNA，传统的观点认为它们仅仅在DNA到蛋白质的遗传信息传递中充当“桥梁"。近年来的研究表明，RNA的种类及其在生命活动中所发挥的作用远比人们想象的要复杂。无论在原核生物还是在真核生物中，细胞内除了编码蛋白质的mRNA外，还存在数量众多、种类各异的非编码RNA(non-codingRNA，ncRNA)，其中一部

2、分ncRNA的长度介于20--500nt，因此这类分子又被称为小分子非编码RNA(smallnon-codingRNA，sncRNA)。SncRNA可以作为结构分子或调控分子与蛋白质协同参与细胞内复杂的生命活动。蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia，以下简称贾第虫)是一种介于原核生物和真核生物之间的单细胞病原微生物，国际上大多数学者认为它是迄今为止最原始的真核生物之一，有“活化石’’之称，因此贾第虫是研究sncRNA的种类、结构与功能以及基因进化的一种良好的模式生物。贾第虫的整个生活史中有两种细胞形态：营养性的滋养体和具有感染性的包囊。滋养体在逆境胁迫下向包囊的

3、分化代表了生物对逆境的最原始的适应。揭示参与这一过程的sncRNA的种类和生物学功能将补充真核生物基因调控网络，并且有助于更进一步地去理解生物对逆境的适应与进化，同时也将为贾第虫病的预防、诊断和治疗提供新的思路和切入点。本研究在鉴定贾第虫包囊分化特异表达的sncRNA的过程中，揭示出一类长度约为46nt的小分子RNA。它们稳定存在于包囊分化24Ilr后的贾第虫细胞中，并且有着较高的丰度，在溴化乙锭染色的凝胶中可以被直接观察到。序列分析结果表明，这些分子不是细胞内RNA的随机降解片断，大部分序列来自于成熟ⅡI蓝氏贾第鞭毛虫包囊分化及逆境胁迫下sncRNA的研究tRNA的3

4、’部分，且切割位点几乎都位于tRNA---叶草型二级结构的反密码左臂，因此被命名为sitRNA(stress．inducedtRNA．derivedRNAs)。tRNA切割为sitRNA的现象普遍存在于贾第虫的整个tRNA家族，而不是某些tRNA所特有切割的现象。与文献报道的tRNA半分子有所不同，sitRNA在包囊分化初期(3hr)便开始迅速积累，且随着培养时间的延长，它们并不是趋于降解，而是在整个包囊分化过程中稳定表达，在24hr丰度最高。这一现象揭示sitRNA在贾第虫包囊分化的起始及维持过程中发挥着重要的作用。包囊分化是贾第虫对外界恶劣条件所做出的一种适应性生存

5、反应，那么其它逆境胁迫是否也能诱导sitRNA产生?本研究检测了低温、高温及血清剥夺培养等胁迫条件下的滋养体细胞，发现tRNA成熟体均可被诱导切割为sitRNA分子。尤其在血清剥夺后，sitRNA在很短的时间内即可出现，并且随着饥饿时间的延长，成熟tRNA及sitRNA逐渐被降解，而此时大量的tRNA半分子在细胞中积累。尽管低温、高温及血清剥夺不能诱导贾第虫滋养体向包囊分化，但它们与包囊分化过程的一个共同特点是机体的整体代谢水平明显下调。与tRNA半分子不同，sitRNA在贾第虫应激过程中稳定存在，并且当压力撤除后，sitRNA又可以消失。据此可以推测，tRNA在应激过

6、程中被切割成sitRNA分子与细胞基因表达整体水平下调有关，从而使贾第虫在胁迫条件下维持相对较低的代谢水平。因此，本研究认为，sitRNA的产生是贾第虫包囊分化及对逆境所作出的一种普遍反应。其它生物的tRNA是否能够被诱导切割为sitRNA分子以应对突发的生理和外界环境的变化?这是一个值得深入探讨的课题。目前，除了贾第虫外，在其它生物中尚未发现sitRNA分子。因此，贾第虫可作为研究生物应对不利环境和适应性机制的良好模式。进一步研究贾第虫sitRNA分子的加工过程及生物学功能将有助于阐明原生动物维持生活周期以及对逆境做出快速和恰当反应的机制。在贾第虫滋养体向包囊分化的过

7、程中是否还存在其它不能经溴化乙锭染色检测的低丰度的sncRNA?因此本研究采用了Solexa高通量测序技术，以期系统地研究滋养体和包囊分化24llr的细胞中sncRNA的种类、丰度及表达上的差异。序列分析结果表明，在滋养体和包囊中存在大量~26nt的GilM／GilT反转座子及mRNA来源的内源性siRNA。其中GilM／GilT反转座子相关的rasiRNA可能通过介导反转座子的基因沉默和端粒的异染色质形成，从而维持基因组的稳定性：mRNA来源的siRNA可能在转录后水平调控相关mRNA的基因沉默。此外，本研究在滋养体和包囊文库中鉴定出5