利用定点突变技术鉴定铜绿假单胞菌ampg基因功能关键位点

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1、万方数据论文题目：型旦定点塞銮堇苤鉴定塑堡堡皇照苴ampG基因功能差键焦点莶囚切日医太斑世恳答辩委员会主席：．立』垒遂!￡!虱匡茎型笪亟答辩委员会成员：走±塑!之!函数垄鱼丕亟i垒型匡銎堕簋堑芏!墨型垒歪三丛鱼院剑尘鏊i基纠区叠丝万方数据温州医科大学硕士学位论文目录I嘴嬲缩略词表⋯．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯．．．．⋯．．．：j⋯⋯⋯⋯2中文摘要⋯⋯⋯．．．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．。3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯．．6前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．9日U舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．了材料与方法⋯⋯．．．．⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．131．1材料⋯⋯．．．．．⋯⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯131．1．1实验菌株的来源⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯131．1．2主要实验仪器⋯⋯⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯．．131．1．3主要实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．131-2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．141．2．1提取基因组DNA．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．141．2．2根据预测的AmpG氨基酸保守位点设计引物⋯⋯．151．2．3重组PCR⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．161．2．4构建克隆载体(TA克隆)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯181．2．5构建表达载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．201．2．6PA01／＼az

3、pO-ampG’菌株进行药敏实验(Amp—MIC)．．211．2．7PA01△黝pG-ampG’菌株酶活测定⋯⋯⋯⋯⋯221．2．8PA01AampG-ampG7菌株进行RT—PCR⋯⋯⋯⋯23实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．1PAOI模板DNA电泳结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．242．2卸占’重组PCR电泳结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．3TA克隆后T-amp6’电泳结果及质粒双酶切后电泳结果．．252．4amp67测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．5pUCP24一ar耍pG7质粒电泳结果及质粒双酶切后电泳结果．262．6PA01／

4、＼amp6一amp67双酶切后电泳结果⋯⋯⋯⋯⋯262．7Amp-MIC、酶活性测定及实时定量PCR结果⋯⋯⋯⋯27分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．35附录⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．．．．⋯⋯．．36致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39万方数据温州医科大学硕士学位论文缩略词表简写英文全称中文全称RT．PCRrealtimequantitativepolymerasechain实时定量聚合酶链反应reac

5、tionDNANCBIdeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸NationalCenterforBiotechnology美国国家生物技术信息中心InformationORFOpenReadingFrameLBSDSmln℃Trismol／L¨lmlAmpPEG甲mMICLuria．Bertanisodiumdodecylsulfateminutecelsiustemperature开放阅读框溶茵肉汤十二烷基硫酸钠分钟摄氏温度trishydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷moleperlitremicrolit

6、ermilliliterampicillinpolyethyleneglycolrotationperminute摩尔每升微升毫升氨苄西林聚乙二醇转每分minimuminhibitoryconcentration最低抑菌浓度2万方数据温州医科大学硕士学位论文利用定点突变技术鉴定铜绿假单胞菌ampG基因功能关键位点中文摘要【目的】ampG基因编码的AmpG蛋白是一种跨膜蛋白，其转运胞膜外糖肽至胞内，诱导AmpC酶的表达。因此，开展AmpG结构与功能的关系及其对细胞内AmpCB．内酰胺酶表达水平影响的研究具有特别重要的意义，也为探寻有应用前景的抑制跨膜转

7、运蛋白功能的药物打下实验基础，对细菌性感染的治疗具有重要的理论意义和应用前景。【方法】1．提取基因组模板：本课题以本实验室保存的铜绿假单胞菌标准株PA01为实验菌株来源，采用SDS法提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA。2．重组PCR：根据预测的AmpG氨基酸保守位点设计引物，以提取的铜绿PA01的基因组DNA为模板，通过重叠延伸PCR技术定点突变ampG基因，使其编码的AmpG蛋白的第129、131个氨基酸发生突变，获得重组片段ampG’，电泳检测并回收重组片段ampG’。3．构建克隆载体(TA克隆)：本实验选用pMDl8．T载体，目的

8、片段ampG’经纯化后连接到pMDl8．TSimpleVector上，得到连接产物T-ampG’；将连接产物