自噬对hemin处理后人胶质瘤细胞u251的作用及相关机制探讨

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目自噬对Hemin处理后人胶质瘤细胞U251的作用及相关机制探讨研究生姓名张璐指导教师姓名陶陆阳（教授）专业名称药理学研究方向神经创伤与修复论文提交日期2013年4月自噬对Hemin处理后人胶质瘤细胞U251的作用及相关机制探讨中文摘要中文摘要目的：研究hemin对星形胶质细胞损伤后细胞内自噬的变化、对细胞的作用以及相关机制。方法：运用人胶质瘤细胞U251，采用适当浓度的hemin（30μM）建立星形胶质细胞体外脑出血模型—hemin损伤模型；CCK-8检测人胶质瘤

2、细胞U251细胞的存活率；荧光染料碘化丙啶（PI）检测hemin诱导的细胞质膜完整性的破坏情况；WesternBlot检测不同的时间点12h、24hhemin处理后自噬相关蛋白LC3和凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白的表达；给予自噬抑制剂3-MA（10mM）及mTOR抑制剂Rapamycin（100nM）后，通过CCK-8及免疫荧光技术检测自噬在神经细胞损伤中所起的作用；给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）后，CCK-8检测人胶质瘤细胞U251细胞的存活率，WesternBlot检测NAC对模型中星形胶质细胞自噬相关蛋白

3、LC3，和凋亡相关蛋白Bcl-2的影响；给予质膜修复剂泊洛沙姆188（P188；100μM）后，通过CCK-8检测P188对hemin引起的神经细胞损伤的影响。结果：（1）成功利用hemin建立了体外星形胶质细胞出血模型；CCK-8结果证实了hemin处理后对胶质细胞的损伤作用，并且具有时间及浓度依赖性；PI荧光结果显示hemin处理后质膜完整性遭到破坏；免疫荧光技术检测发现，在ICH后12h及24h时，Hemin处理组与阴性对照组相比，自噬相关蛋白Beclin1的表达量明显上升，而且TUNEL阳性细胞数增多。（2）

4、hemin可以诱导胶质细胞发生自噬，且自噬在细胞死亡中扮演“双刃剑”作用。CCK8法检测发现，Hemin(30μM/L)处理U251细胞后，在12h3-MA能降低细胞的存活率，Rapmaycin能提高细胞的存活率；在24h3-MA能提高细胞的存活率，而Rapmaycin却能降低细胞的存活率。Westernblot检测发现，Hemin(30μM/L)处理U251细胞后，在12h3-MA组Bcl-2蛋白水平与Hemin组相比明显下调，Rapmaycin组Bcl-2蛋白水平与Hemin组相比明显上调；在24h3-MA组Bc

5、l-2蛋白水平与Hemin组相比明显上调，Rapmaycin组Bcl-2蛋白水平与Hemin组相比明显下调。提示在体外脑出血模型中在不同的时间点自噬的作用不同。（3）抗氧化剂NAC能够降低hemin引起的细胞损伤。Hemin与抗氧化剂NAC联合使用，CCK-8检测结果发现10mM/LNAC的效果最好，提示抗氧化剂NAC能降低Hemin对U251细胞的损害作用。Hemin与抗氧化I中文摘要自噬对Hemin处理后人胶质瘤细胞U251的作用及相关机制探讨剂NAC联合使用后Westernblot结果显示，与对照组相比，在12

6、h、24hLC3蛋白水平均显著地下调，Bcl-2蛋白水平均显著地上调，提示抗氧化剂NAC通过下调自噬与凋亡的水平来减弱Hemin对U251细胞造成的氧化损伤，自噬可能处于hemin引起的氧化损伤的下游。（4）质膜修复剂P188具有神经保护作用。CCK-8结果发现，Hemin与质膜修复剂泊洛沙姆188（P188）联合使用，与阴性对照组相比细胞的存活率明显升高，我们发现100μM/LP188的效果最好，提示质膜修复剂泊洛沙姆188能降低Hemin对U251细胞的损害作用。CCK-8结果发现，质膜修复剂P188与抗氧化剂N

7、AC联合使用，与单纯给P188、NAC相比细胞的存活率都升高，提示质膜修复剂泊洛沙姆188与抗氧化剂NAC作用的机制可能不同。结论：1.Hemin对人胶质瘤细胞U251具有明显的生长抑制作用，并且有一定的时间和剂量依赖性，且伴随有质膜的破坏。2.Hemin能诱导U251细胞发生凋亡与自噬，而且自噬在不同的时间点所起的作用不同：Hemin作用U251细胞后12h时，自噬起保护作用；Hemin作用U251细胞24h时，自噬促进细胞死亡，说明自噬是一把“双刃剑”。3.Hemin对U251细胞的损伤作用主要是引起氧化损伤，抗

8、氧化剂NAC的这种保护作用是通过下调凋亡来发挥作用，自噬可能处于氧化损伤过程的下游。4.Hemin对人胶质瘤细胞U251的毒害作用会引起脂质过氧化作用，引起质膜的损害，而质膜修复剂泊洛沙姆188能降低Hemin对U251细胞的损害作用；质膜修复剂泊洛沙姆188与抗氧化剂NAC的联合使用比它们单独细胞的存活率都要高，提示我们质膜修复剂泊洛沙姆18