自噬在造血系统中的辐照保护作用

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2、内容相一致。苏州大学有权淘国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心‘中国科学技术瘩息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借嗣，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文凸本学位论文属在年月解密岳适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：导师签名：E1期：兰!竺!!口·8万方数据自噬在造血系统中的辐照保护作用中文摘要目的：造血干细胞是各类血细胞的来源，电离辐射可能导致造血系统细胞的DNA损伤，而这些损

3、伤如果不能被有效修复，极有可能引起染色体重排，导致基因组不稳定、细胞凋亡甚至癌变。迄今，尚无利用自噬机制增强机体抗辐射保护造血干细胞基因组稳定的研究。本研究利用条件性基因敲除小鼠模型(自噬机制缺失)和腹腔注射mTOR抑制剂rapamycm的小鼠模型(激活自噬机制)，阐明造血干／祖细胞在核辐射后其DNA损伤修复作用是否依赖于自噬机制以及阐明自噬通过何种方式保护辐照下的造血干／祖细胞。具体目标：A)研究自噬机制是否通过有效清除ROS来保护造血干／祖细胞。B)研究白噬机制与辐照引起的造血干／祖细胞DNA损伤修复途径的关联和作用机制。方法：从小鼠骨

4、髓中分离出正常骨髓细胞体外培养，经rapamycin激活或bafilomycinA1抑制自噬，提取蛋白，WesternBlot检测LC3、4EBPl。将BM细胞不同药物处理24h后辐照3Gy，分别于辐照前及辐照后24h、48h和72h进行细胞计数和凋亡检测(AnnexinV／PI)，于辐照前、后2h分别用3，-H2A．X流式检测和免疫荧光观察骨髓细胞DNA双链损伤情况。为了进一步验证在体内激活自噬能否同样对造血系统有辐照保护作用，Ctrl组和Rap组分别在小鼠腹腔注射vehicle和rapamycin，共5次。小鼠整体辐照5Gy，分别于辐照

5、前、辐照后短期时间6h、ld、3d、5d、7d及辐照后长期时间40d、70d和100d测外周血象。BM用ficoll液梯度离心得到的全骨髓单个核细胞，接着用磁珠分选出lin+和lift细胞，再用流式细胞仪分选出lin一细胞中标记Scal和c—kit抗体双阳性的细胞群LSK。辐照24h后分别取BM、lin+、lin一和LSK细胞流式检测，／-H2A．X的阳性细胞率。比较Ctrl组和Rap组小鼠辐照前，及辐照1Gy和3Gy后骨髓细胞的集落生成能力。流式检测两组小鼠辐照前后体内LSK、LT-LSK、ST-LSK的占全骨髓单个核细胞数的比例。进而，

6、取At97∥f-MXl一Cre四周龄的小鼠腹腔注射PIPC，注射完6周后，取小鼠进行基因鉴定。冲骨髓提取RNA和蛋白，检测At97在骨髓mRNA水平及蛋白万方数据中文摘要自噬在造血系统中的辐照保护作用水平都被敲除。将Ctrl组和At974组小鼠整体辐照5Gy，测量外周血象、24h后取LSK细胞流式检测7-H2A．X的阳性细胞率。At974组小鼠在辐照前分别腹腔注射vehicle和rapamycin，5Gy辐照后比较两组的外周血象和辐照8h后流式检测两组外周血的丫-H2A．X的阳性细胞率。比较Ctrl、Rap和At97十三组小鼠辐照前，及辐照

7、5Gy后骨髓细胞的集落生成能力。同时流式检测Ctrl组和At97+组小鼠辐照前后体内LSK占全骨髓单个核细胞数的比例。DCF探针检测各组骨髓细胞ROS产量的差异，利用QIAGEN公司的RT：Pr06lerTMPCRArrayMouseDNARepair检测Ctrl组、Rap组和At97斗组5Gy辐照4d后LSK中DNA损伤修复相关基因的表达。并通过流式细胞仪检测参与HR和NHEJ途径的Rad51和DNAliglV的蛋白表达阳性率，WestenBlot检测HR和NHEJ途径相关蛋白的表达变化。H&E染色显示三组小鼠辐照前后的脾切片。结果：不同

8、药物体外处理骨髓细胞，24h后Rap组LC3一I转化LC3．II增高，表明体外给予rapamycin提高了细胞的自噬水平。各药物处理组细胞辐照前的增殖速度和凋亡与C仃l组比较没有