猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

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1、内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：莹!夔日期：—堂地内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工

2、作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：擅!皇特教师擞：鳟日摘要猪传染性胃肠炎(TransmissibleGastroenieritisofswine，TGE)是一种以仔猪出现严重腹泻、呕吐和脱水为特征的高度接触性肠道传染病，其病原为猪传染性

3、胃肠炎病毒(TransmissibleGastroenteritisVirusofSwine，TGEV)。临床上TGEV与同种属的其他腹泻病毒难于区分，致使对该病的诊断和预防带来了很大困难。由于单克隆抗体对抗原的识别具有特异性，因此在疫病病原的诊断中优势突出。而单克隆抗体识别的抗原表位，有助于了解TGEV抗原结构与功能的关系，对该病的诊断具有重要意义。本研究首先用差速离心的方法纯化TGEV，以纯化病毒为免疫抗原，经皮下多点注射免疫BABL／c小鼠，三次免疫后进行细胞融合，利用TGEV感染的PKl5细胞进行间接免疫荧光检测，筛选阳性杂交瘤细胞株，

4、并利用有限稀释法克隆阳性细胞株，对经三轮以上筛选为阳性的细胞株进行扩大培养和低温冻存，同时利用BABUc小鼠制备腹水迸～步验证，试验结果表明我们获得了一株能稳定分泌抗TGEV抗体的杂交瘪细胞株，命名为4E2。利用纯化的TGEV对4E2单克隆抗体进行Westernblot分析，结果显示单克隆抗体4E2特异性识别约为47kD的N蛋白。为了进一步确定单抗4E2所识别的病毒蛋白，我们克隆获得了TGEV的N基因，同时将N基因分成N1和N2，分别将其亚克隆至原核表达载体pGEX6p．1、pET一30a中，获得重组表达载体pGEX6p—N、pET-30a—N

5、1，并分别在大肠杆菌中进行了表达，利用TGEV阳性鼠血清对表达产物进行Westernblot分析，证实表达的两个融合蛋白都具有较好的反应活性。然后分别以表达的融合蛋白为抗原，对获得的单抗4E2进行间接ELISA和Westernblot检测，结果显示单抗4E2可以特异性识别TGEVN蛋白以及N1蛋白，进一步证实我们获得的单抗4E2是针对TGEVN蛋白，而且其所识别的抗原表位位于N蛋白N端192个氨基酸，本研究结果为今后临床中对TGEV的可靠性诊断提供了有效工具。为弄清近年在上海某猪场发生的仔猪腹泻疫情病因，我们随机采集发病猪场的仔猪腹泻样品9份，

6、利用RT—PCR方法对采集样品进行病原检测，结果显示，9份临床样品中有4份为猪轮状病毒(PoreineRotavirus，PoRV)阳性，而猪流行性腹泻病毒(PEDV)和TGEV均为15月性；根据GenBank公布的PoRV参考株序列设计两对引物，对其中阳性样品的VP6和VP7基凶进行RT．PCR扩增、基因克隆和序列测定分析，结果显示，4份阳性样品的VP6基因大小为1356bp，VP7基因大小为l100bp，根据结果分析，我们确．定此次仔猪腹泻疫情中的主要病原是由属于A群G9血清型的PoRV引起，本研究为此次仔猪腹泻疫情的诊断提供了依据。关键词

7、：猪传染性胃肠炎病毒；单克隆抗体；抗原表位；猪轮状病毒；序列分析GenerationandIdentincationofMonoclonalAntibodiesAgainstofTransmissibleGastroenteritisVirusofSwineAbstractTransmissibleGastroenieritis(TGE)ofswineisakindofcontagiousdiseaseofpigs，causingwaterydiarrhea，vomiting，weightloss，anorexia，whichpathogeni

8、sswineTransmissibleGastroenteritisVirus(TOEV)．Inclinicaldiagnosis，itisdiffi