猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备及纯化工艺研究

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1、万方数据分类号：暨5窆：竖密级：垒珏单位代码：!QQ墨鱼学号：2Q!!垒!!猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卯黄抗体的制备及纯化工艺研究StudyonPreparationandPurificationTechnologyoflgYAgainstTGEVirusandPEDVirus学位申请人：指导教师：学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：高岭刘聚祥教授基础兽医学农学硕士河北农业大学二。一四年五月二十八日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人

2、已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑I垦壅些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：离以签字日期：弘渺年乡月≥7日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑主垦盛些盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权塑主堡垒些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名

3、：i{i7砍签字日期：Ⅻ脚年j-月弓7日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师掀幺叩像砑签字日期：彦f≯年，月孑厂日电话：邮编：万方数据【lIllllIIIIIlUlllIIIIIIIIIIlY2668376本研究由河北省科技攻关项目(编号12220405D)和石家庄市科技局项目(编号12150182A)资助万方数据摘要猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻都是由病毒引起猪的消化道传染病，密切接触后感染性较强。该病临床症状有呕吐、严重腹泻、脱水等，以引发初生仔猪高死亡率为特征。据兽医防疫部门统计，这两种疾病在猪的各种传染病中，尤其是低龄仔猪中发病率、死亡率均较高，为

4、影响养猪业健康发展的主要传染病之一。目前针对这两种疾病还没有有效的治疗药物，本试验旨在开发防治TGE和PED的卵黄抗体，研究该卵黄抗体提取纯化工艺，期望为这两种疾病的防治和该卵黄抗体的规模化生产提供理论依据和技术支持。本试验为制备猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病毒卵黄抗体所用的免疫原为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒二联灭活疫苗。免疫方案中设定两个剂量不同的试验组和一个对照组，按照一定的程序免疫鸡群，刺激机体产生抗TGE和PED的卵黄抗体。采用猪传染性胃肠炎病毒ELISA试剂盒和猪流行性腹泻病毒IgY抗体PPA-ELISA检测试剂盒，检测鸡群血清抗体和卵黄抗体效价

5、变化趋势；建立并检测PED和TGE抗体共同作用的间接ELISA方法，建立的方法中采用上述疫苗为包被原，兔抗鸡．HPR为酶标二抗，经方阵滴定法确定包被原和二抗的最佳工作浓度；卵黄抗体的提取工艺的研究中，采用水稀释辛酸法、超滤法、硫酸铵盐析法的联合方法作为规模化提取纯化卵黄抗体的工艺，并确定联合法的最佳工艺参数，试验结果如下：试验中采用TGE和PED二联灭活疫苗为免疫原，免疫蛋鸡，收集高免蛋并处理，结果获得了卵黄抗体浓度、卵黄抗体效价变化趋势、血清抗体效价的变化趋势以及两种抗体共同作用的效价变化趋势。卵黄抗体在首免后一周内逐渐产生，抗体效价波动性小，两种病毒卵黄抗体效价

6、(OD450值)最高达2．900左右，强化免疫后高效价卵黄抗体可维持4周以上；卵黄抗体浓度变化幅度小，整个检测过程中生产的卵黄抗体浓度最高时可达9．50mg／mL；血清中两种抗体共同作用效价最高达到5500。设定的两个剂量试验组中，血清中抗体和卵黄抗体在两组中均不存在显著性差异(尸l>0．05)，各试验组和对照组差异极显著(P．<0．01)；确定的免疫程序为，胸部肌内注射免疫原，基础免疫剂量为1．0mL，随后每间隔两周进行一次常规免疫，剂量分别为1．0mL，第二次和第三次常规免疫剂量均为1．5mL，四周后进行强化免疫，剂量为1．0mL，对照组同期均注射同等剂量生理盐

7、水。建立检测TGE和PED抗体共同作用的间接ELISA方法，确定包被原、酶标二抗最佳工作浓度分别为400倍和7000倍稀释，通过敏感性、特异性、重复性试验确定建立的间接ELISA方法具有可行性。试验中确定的水稀释辛酸法、超滤法、硫酸铵盐析法联合提取卵黄抗体的各参数条件和过程为：一份卵黄液中加入9倍4℃蒸馏水、1％辛酸后充分搅拌均匀并于4℃静置12h，4。C、12000rpm离心25min，获得的上清液调节pH为7．5，温度为25℃，采用50kDa膜包，在0．025MPa压力下进行超滤，获得浓缩液再调节pH为7．0，加入等体积PBS缓冲液后，分别加入50％、33％