大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究

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1、江苏大学博士学位论文大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究姓名：曹辉申请学位级别：博士专业：农产品加工及贮藏工程指导教师：吴春笃20081215摘要以大米蛋白为原料研究抗氧化肽的制各技术及其性能。采用酶水解大米蛋白的方法生产高活性的抗氧化肽。以酶解液对DPPH自由基清除率为考察指标，从七种商品蛋白酶中筛选出三种蛋白酶：风味酶、中性酶、木瓜蛋白酶；分别进行正交试验，得出三种酶在各自最佳作用条件下对DPPH自由基清除率分别为75．2％、89．5％和58．8％；大米抗氧化肽的ECso值分别为2．92mg／mL、2．

2、17mg／mL和3．86mg／mL。在各自最佳反应条件下得到的三种酶的水解产物，进行DPPH自由基清除率和EC50值的横向比较，最终确定中性蛋白酶为本试验用酶，其最佳制备工艺参数为，底物浓度109／100ml，加酶量8％，酶解pH6．0，酶解温度60。C，时间30min。在大米蛋白单酶水解实验基础上，将选出的三种酶两两组合，进行双酶分步水解试验，发现加酶顺序对水解产物的抗氧化活性有较大的影响；同时第一步酶解后灭酶明显优于不灭酶。最终比较得到最优组合：大米蛋白先经中性酶水解30min，灭酶后再由木瓜酶水

3、解15min，得到的酶水解产物ECso为1．23mg／mL,与单酶相比下降了43．3％。在超声功率1500W、超声初始温度40℃条件下超声处理大米蛋白溶液20min，再用中性酶水解制备抗氧化肽，其DPPH自由基清除率可达至1J74．8％，ECso为0．932mg／mL。超声处理原料使水解产物I拘IEC50江苏大学博士学位论文：大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究值比没做处理的显著下降了57．1％。研究了制备得到多肽的抗氧化性能试验，发现大米抗氧化肽具有较强的清除OZ．-DPPH自由基、羟自由基，其EC50分

4、别为0．0678mg／mL、0．932mg／mL和0．117mg／mL。以732阳离子交换树脂、SepHadex．G25和HPLC制备柱纯化大米抗氧化肽，最终研究得到两种抗氧化肽。使用美国ABI的串联飞行质谱仪4700TOF／TOF对分离到的抗氧化肽进行结构分析，得到两个多肽序列分别为Gly．Val．Pro．Ser-Ala．Val．Ser-Arg-Asn-Met—Thr-Arg-Ser-Arg和Leu一灿a-Ser-Gln-His-Leu-Val-Ala-lie—Leu—Asp-Pro—Pro-Arg

5、，其EC50值分别为：4．911xM和5．39}tM。关键词：大米蛋白，抗氧化肽，超声，酶解，制备技术，性能ⅡABSTRACTThepreparationtechnologyofanti—oxidantpeptides，whichderivedfromhydrolysisofriceproteinbyenzyme，andthepeptides'scharacteristicswereinvestigatedinthisstudy．Threecommercialproteases，flavor,neut

6、ral，andpapain，wereselectedfromsevenonesaccordingtotheeliminationratesof1,1··Diphenyl—-2·-picrylhydrazylpPP马freeradicalofhydrolytes．Orthogonaltestswereperformedtodetermintherespectiveoptimumhydrolysisconditionofeachprotease．AndthediminationrateofDPPHfree

7、radicalofeachoptimumhydrolyzedsolutionwere75．2％．89．5％and58．8％，respectively．ThevaluesofECsooftheanti—oxidantpepfideproductswere2．92me／mL，2．17me／mE,and3．86me／mL,respectively．TheneutralproteaseWaSpreferredbecausethehydrolatebytheneutralproteaseshowedthehig

8、hestanti—oxidantactivityinthethreeones．Andtheoptimalenzymatichydrolysistechnologicparameterswereasfollowings：theconcentrationofsubstrate10e／100ml，thequantityofprotease8％，pH6．0at60"Cfor30min．Thecombinationsoftwoenzymatichydrolysis