抗诺如病毒鸡卵黄抗体的制备及其初步应用研究

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文抗诺如病毒鸡卵黄抗体的制备及其初步应用研究PreparationofeggyolkantibodyagainstNorovirusandPrimaryApplication-一一课题来源：自选课题学位申请导师姓专业名培养类培养层所在学人王云芸名聂军教授称流行病与卫生统计学型学术型次硕士研究生院公共卫生与热带医学学院答辩委员会主席杨翌教授答辩委员会委员曾年华陈青山胡贵方江晓玲研究员副教授教授副教授2013年6月08日广州硕士学位论文抗诺如病毒鸡卵黄抗体的制备及其初步应用研究硕士研究生：王云芸

2、指导教师：聂军教授摘要研究背景：诺如病毒(Norovirus，Nov)与札幌样病毒(SapporolikeVirus，SLV)合称为人类杯状病毒(Calicivirus)。该病毒是于1972年，由Kapikian在1968年美国Norwalk地区暴发的急性胃肠炎患者的粪便中采用免疫电镜法检测出来的球状病毒颗粒，直径在27—32nm之间。如今，Nov已成为非细菌性急性胃肠炎的主要病原体。可在幼儿园、夏令营、学校、医院、养老院、餐馆、部队(航海舰队)与游船等小型单位引起暴发，所有年龄段均可被感染。对新世纪多次暴发的腹泻病原分析

3、发现，GII型Nov已成为全球病毒性胃肠炎最常见的Nov病毒株，其中GII．4型_Nov毒株占主导地位。目前主要采用RT-PCR法检测食物、粪便和水中的Nov，此法敏感性较高、重复性好，但耗时较长，仪器设备要求较高。且由于毒株的多样性，RT—PCR必须要使用混合引物。如今，RT—PCR已逐渐被荧光定量PCR取代，后者更加快速和灵敏，特别是使用Taqman探针时，单次试验即可提供证据并进行定量检测，但此法仪器设备要求高，很难在现场和基层普及。禽类血液中的抗体IgG可转移到卵黄液中，并在胚胎发育过程中对潜在的各种病原体感染起到

4、被动保护作用，这种抗体称为卵黄抗体即IgY。IgY是存在于禽蛋卵黄中的主要抗体，属多克隆抗体，在疾病诊断和防治的应用方面有许多优点。通过免疫血清的途径一次性制备大量抗体是相当困难的，且多次制备摘要会导致抗体的均一性差。产蛋鸡经免疫后，可从其卵黄不断获得特异性抗体。IgY具有特异性强、纯度高等优点，不会与哺乳动物产生过敏反应或交叉血清反应，可替代通过免疫兔、小鼠等哺乳动物而进行抗体的大量生产。近年来，IgY的研究和应用已经成为免疫学领域的热点。Woolley等用重组人白细胞介素一6分别对羊和鸡进行免疫，制备了IgG和IgY，

5、发现两者对人白细胞介素一6都有很高的亲和力，表明IgY可以代替哺乳动物的IgG进行免疫检测。2003年，de—AlmeidaCM制备了抗BfpAIgY应用于免疫吸附，发现其可以特异性地鉴定EPEC。OhnishiT等用IgY与IgG进行ELISA检测HGF，发现IgY使灵敏度提高了10倍，不但能检测出血中的HGF，还能检测正常人尿中的HGF。Juliarefla等表达了GST—p24融合蛋白，再以此免疫蛋鸡制备了特异性IgY用于免疫诊断。结果表明用IgY检测可避免常规的哺乳动物二抗所带来的交叉反应。IgY作为检测试剂用于一

6、系列的分析技术，将有望更多的应用于诊断试剂的领域，在诊断试剂的开发中发挥重要作用。本研究用GII．4型387型菌株NovP颗粒蛋白抗原作为抗原免疫产蛋来航鸡制备抗Nov卵黄抗体IgY，在此基础上对IgY进行HRP酶标制备酶标抗体，建立用于检测Nov的双抗体夹心ELISA体系，并进行评价。为IgY今后在诊断和疾病防治方面的应用奠定一定基础，并为Nov的检测和防治提供新的思路。研究目的和内容1．制备特异性抗Nov卵黄抗体IgY。2．研究特异性抗Nov卵黄抗体IgY的特性。3．利用特异性抗Nov卵黄抗体IgY建立双抗体夹心ELI

7、SA体系用于Nov的检测，并对其进行初步应用评价。方法：1．抗Nov鸡卵黄抗体IgY的制备(1)采用GII．4型387型菌株NovP颗粒蛋白抗原与等量弗氏佐剂乳化制备免疫制剂，采用多次多点双翅下肌肉注射的方式免疫产蛋来航鸡；II硕士学位论文(2)收集免疫前一周及免疫后三个月内的鸡蛋；(3)改良水稀释法和硫酸铵两次分级沉淀法(终饱和度分别为55％和33％)分离、纯化鸡卵黄抗体；(4)间接ELISA法检测鸡IgY各周期的效价变化；(5)SDS—PAGE电泳鉴定鸡IgY的纯度，Westernblot法鉴定鸡IgY的特异性；(6)

8、考马斯亮蓝法测定鸡卵黄抗体中的总蛋白含量；(7)将卵黄抗体溶液稀释成不同浓度置于25。C室温环境下评价其室温稳定性；在不同pH环境下作用评价其pH稳定性；在不同温度下处理评价其热稳定性；将其用不同pH环境的胃蛋白酶进行处理，评价胃蛋白酶对鸡卵黄抗体的影响；在一20℃与4。C环境下反复冻融5次，评价反复冻