嗜热链球菌耐酸机制的初步研究

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1、万方数据分类号：TS201．6密级：(秘密、机密、绝密)学校代码：10057研究生学号：11813022嗜热链球菌耐酸机制的初步研究PreliminaryStudyonAcidResistanceMechanismofThermophilicStreptococcus专业名称：营养与食品卫生学指导教师：王俊平教授研究生姓名：李晓敏申请学位级别：医学硕士论文提交日期：2014年3月论文课题来源：合作项目学位授予单位：天津科技大学万方数据天津科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在

2、导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果内容，也不包括为获得天津科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：碡嗽苏。日期：功／纩年≥月2／日知识产权和专利权保护声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师具体指导下并得到相关研究经费支持下完成的，其数据和研究成果归属于导师和作者本人，知识产权单位属天

3、津科技大学；所涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技大学所有。本人保证毕业后，以本论文数据和资料发表论文或使用论文工作成果时署名第一单位仍然为天津科技大学。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：舭彩L日期：≯叫妒年■调2／／日学位论文版权使用授权书雠名：艨晴妨蚋翟勘年挪7日导师签名：7刃後乏强日期：御≯车乞篇2弓日9＼／万方数据摘要嗜热链球菌作为酸奶的发酵剂在后酸化过程中发挥重要的作用，本论文旨在对嗜热链球菌的耐酸机制进行初步研究，为嗜热链球菌耐酸机制的阐明奠定了基础，同时也

4、为酸奶后发酵的控制提供了理论指导。通过对嗜热链球菌在不同乳糖含量的IRIE培养基中培养，明确了嗜热链球菌的生长特征。对处于对数生长初期的嗜热链球菌进行酸刺激处理lh，采用蛋白质组学分析方法对比刺激前后蛋白种类与表达量的变化，结果为培养到对数初期(4h)的蛋白点为665个，酸刺激后(5h)的蛋白点为677，其中有12个蛋白点在5h样品中存在而在4h样品中不存在。提取5h的表达量相对于4h的表达量多于1．5倍以上的70个蛋白点进行质谱鉴定，根据其在酸性环境中的功能大致分为以下凡类：与金属离子压力相关的

5、蛋白4种，与逆境下修复保护机制相关的蛋白5种，与代谢途径相关的一些酶和亚基27种，与ATP合成酶蛋白，转录因子相关的蛋白11种，与氨基酸代谢相关的酶蛋白8种，其他功能蛋白10种。挑选其中四个蛋白Alpha．acetolactatedecarboxylase、UreaseG、UreaseE和60KD进行实时定量PCR(RT-qPCR)验证其在转录组水平上的表达量变化，结果5h样品相对于4h样品表达量分别为15．24倍、13．27倍、8．40倍和0．60倍，蛋白Alpha．acetolactatede

6、carboxylase、UreaseG和UreaseE在转录组水平上与蛋白质组学分析结果一致，而蛋白60KD却呈现不一致的变化。CiaH是一种可能的耐酸性相关基因，本研究成功构建了该基因的敲除载体，并进行了初步的敲除实验。根据CiaH上、下游基因序列设计引物，扩增出长度为641bp和698bp的上下游同源臂，并利用酶切、连接将其插入到pMD18．T中；PCR扩增氯霉素抗性基因，通过酶切、连接后将其插入到重组pMD18．T载体中的上下游片段之间，成功构建基因敲除载体。将敲除载体线性化以后转入嗜热链球

7、菌，在氯霉素抗性平板上筛选基因敲除突变株，经过多次筛选未能获得基因敲除突变株。可能是由于基因敲除后形成致死突变，导致缺失菌株无法存活。目前，对于嗜热链球菌耐酸性基因比较全面的研究还未见报道。本研究利用比较蛋白组学方法，对嗜热链球菌可能的耐酸因子进行了系统的筛选。本研究的开展为嗜热链球菌耐酸机制的阐明以及酸奶后酸化的控制奠定良好的基础。关键词：耐酸性；双向电泳；质谱鉴定；分类；载体构建万方数据ABSTRACTAsayoghurtstarterThermophilicstreptococcusplay

8、sanimportantroleintheprocessofacidification．ThispaperisaimedatapreliminarystudyontheacidresistancemechanismsofT．streptococcusandlaidafoundationforillustratingthemechanismofacidresistance，aswellascontrolyogurtfermentation．Thegrowthcharacteristi