westernblot步骤

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1、Westernblotprotocol步骤：1.分离胶和积层胶，制胶板；注意：灌分离胶时不要加太多。2.蛋白变性：准备蛋白样本，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min）3.加样：每孔加入20～40μl样品4.电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA；5.取出胶板，用切割刀修好胶；6.将胶置于转膜液中浸泡；7.按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→NC膜→滤纸（用吸管赶去气泡）→海绵；8.置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；9.装好电极，于恒定电压100V

2、下，90min；10.丽春红染膜；11.用TBST洗去丽春红；12.封闭：加入5％脱脂奶粉＋TBST，常温摇床摇1h；13.回收封闭液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀释】；14.置于4℃摇床摇过夜；15.回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；16.加入二抗【二抗用5％脱脂奶粉＋TBS稀释】，常温摇床摇1h；17.回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；18.将膜置于发光液中浸泡约1min；19.将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。常用溶液配制：Ⅰ细胞裂解液（PLCLysisBuffer）Finalconcentration100ml500ml1MH

3、epes(pH7.5)50mM5ml25ml5MNaCl150mM3ml15mlGlycerol10%10ml50ml50mMMgCl21.5mM3ml15mlTriton×1001%1ml5ml0.5MEDTA(pH8.0)1mM200μl1ml0.1MNaPPi10mM10ml50ml0.5MNaF10Mm2ml10ml每次提取蛋白前加入1％蛋白酶抑制剂Ⅱ.SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制1．30%丙烯酰胺丙烯酰胺29gN-N’-亚甲双丙烯酰胺1g溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃使其溶解，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45

4、μm孔径）过滤除菌或Whatman1号滤纸过滤，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。注：（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。（2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。（3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。每隔数月应重新配制溶液。2．3MTris-HCl,pH8.8（用于分离胶）Tris碱分子量为121.1。将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH至8

5、.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。加重蒸水定容至200ml，1.034×105Pa，20min高压灭菌，RT贮存。注：(1)如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris.(2)Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。3．2MTris-HCl,pH6.8（用于积层胶）同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。4．10%十二烷基硫酸钠（SDS）在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。注：S

6、DS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。5．TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。6．10%过硫酸胺过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。方法：把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4℃保存数周。7.电泳缓冲液SDSbu

7、ffer:10X（runningbuffer）Trisbase30.3gGlycine144.0gSDS10.0gddH2Oto1L(1Xconc:25mMTrisbase,192mMglycine,0.1%SDS,)8.转膜缓冲液TransferBuffer(10×)pH8.3Trisbase30.3gGlycine144.0g20%v/vmethanol(Fresh!)ddH2Oto1L(1Xconc:25mMTrisbase,192mMglycine,200mlmethanol)9.TBST(10X)pH:7.5Trisbase24.2gNaC