猪卵母细胞胞质内单精子注射技术研究

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1、东北农业大学硕士学位论文猪卵母细胞胞质内单精子注射技术研究姓名：孙爽申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：刘忠华20090620摘要摘要卵母细胞胞质内单精子注射（ICSI）作为新型的体外受精技术，可用于研究受精机理、治疗男性不育和生产转基因动物。虽然在许多动物上已经出生ICSI后代，但直到2000年才出生ICSI小猪。与其他物种相比，猪ICSI技术体系还不完善。本实验探讨了不同辅助激活方法、精子不同预处理方法和胚胎培养液中添加半胱氨酸对猪卵母细胞胞质内单精子注射（ICSI）胚胎体外发育的影响。试验一：活精子ICSI卵母细胞分别以CalciumionophoreA23187（Calciu

2、mionophoreA23187激活处理5min）、CalciumionophoreA23187+6-DMAP（CalciumionophoreA23187激活处理5min后间隔4h再用6-DMAP处理3h）和电激活（采用2次直流电脉冲，1.2kv/cm，30µs）三种方法进行辅助激活，对照组在注射后不做任何辅助激活处理。试验二：活精子分别以0.1%TritonX-100处理和液氮一次冻融处理后进行胞质内注射，以活精子为对照组。试验三：ICSI卵母细胞分别在添加1.71mmol/L半胱氨酸的PZM-3胚胎培养液中培养0h（对照组）、4h、12h和168h，然后转移至不添加半胱氨酸的PZM-3

3、培养液中继续培养。结果如下：试验一：与对照组相比三种辅助激活方法均能显著提高注射卵的激活率和受精率（86.57%、96.88%、94.12%vs71.88%；32.84%、43.75%、36.76%vs21.88%）（p<0.05）。A23187+6-DMAP联合激活组受精率显著高于钙离子载体A23187激活和电激活组（43.75%vs32.84%、36.76%）（p<0.05）。A23187+6-DMAP联合激活和A23187激活组第二极体排出率显著高于对照组和电激活组（74.19%、74.14%vs58.90%、54.69%）（p<0.05）。与对照组相比A23187+6-DMAP联合激

4、活和电激活均能显著提高ICSI卵母细胞的卵裂率与囊胚率（69.57%、70.15%vs53.33%；20.29%、25.37%vs6.67%）（p<0.05）。试验二：0.1%TritonX-100处理精子和液氮冻融精子组的受精率显著高于对照组（48.15%、56.36%vs39.34%）（p<0.05）。液氮冻融精子组的雄原核形成率显著高于对照组（74.55%vs52.46%）（p<0.05）。0.1%TritonX-10处理精子和液氮冻融精子组的卵裂率和囊胚率与对照组相比差异不显著（p>0.05）。试验三：在添加1.71mmol/L半胱氨酸的PZM-3培养液中培养4h和12h的ICSI卵

5、母细胞受精率和雄原核形成率显著高于0h组（58.73%、53.70%vs37.29%；71.43%、64.81%vs47.46%）（p<0.05）。在添加1.71mmol/L半胱氨酸的PZM-3培养液中培养4h的ICSI卵母细胞囊胚率显著高于0h、12h和168h组（24.78%vs13.56%、18.52%、12.17%）（p<0.05）。以上结果表明，猪卵母细胞在ICSI后需要辅助激活来启动胚胎顺利发育，A23187+6-DMAP联合激活效果较好。TritonX-100或液氮冻融处理精子对猪ICSI卵母细胞的受精率有促进作用。在添加1.71mmol/L半胱氨酸的PZM-3中培养4h对猪I

6、CSI卵母细胞的受精率、雄原核形成率和胚胎的囊胚发育率均有促进作用。关键词卵母细胞激活；精子预处理；原核形成；ICSI；猪IAbstractStudyonTheTechnologyofIntracytoplasmicSpermInjectioninPorcineAbstractIntracytoplasmicsperminjection(ICSI)isaninvitrofertilizationtechniquevaluableforstudyingfertilization,treatinghumaninfertilityandproducingtransgenicanimals.Alth

7、oughliveICSI-derivedoffspringhavebeengeneratedinmanyspecies,itwasnotuntil2000thatliveICSI-derivedpigletswereborn.IncomparisontoICSIinotherspecies,ICSIinswinehasnotbeenwellestablished.Theobjectiveofthisstudy