原位核酸分子杂交技术

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1、原位核酸分子杂交技术1*第一节原位核酸分子杂交技术的发展第二节原位杂交技术的基本方法（一）固定（二）玻片和组织切片的处理（三）杂交（四）杂交后处理（五）显示（六）对照实验和结果的判断第三节原位DNA和DNA分子杂交方法（一）地高辛（Dig）标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法（二）生物素标记HPV-DNA探针在石蜡切片上检测HPV-DNA的方法第四节RNA原位核酸杂交方法一、基木原理二、RNA原位杂交中探针（一）探针种类（二）探针标记（三）探针的纯化（四）杂交前准备（五）杂交前探针的选择三、cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交（一）组织的前处理（二）RNA探针

2、的标记（三）预杂交（四）原位杂交（五）杂交后处理（六）杂交后显色四、用寡核昔酸探针检测组织中的RNA原位杂交（一）组织的前处理（二）杂交预处理（三）寡核昔酸探针选择和标记（四）预杂交（五）杂交（六）杂交后处理（七）免疫检测及显色（八）阳性信号的评定（九）原位杂交的对照五、用cDNA探针检测体外培养细胞中的RNA原位杂交（一）细胞的准备、固定和细胞的通透（二）原位杂交（三）杂交后洗脱（四）免疫荧光检测六、RNA原位杂交现状和进展（一）组织前处理的改进（二）杂交的信号放大（三）RNA原位杂交与免疫组化双重检测技术（四）多重RNA原位杂交技术第五节地高辛标记寡核昔酸探针的原位杂交

3、方法第六节原位杂交结合免疫细胞化学双标记法一、杂交、免疫组织化学方法二、免疫细胞化学■杂交结合方法三、对照第七节双重原位杂交方法一、放射性探针与生物素探针结合双重杂交方法（一）一步法(二)二步法二、非放射性探针的双重原位杂交方法(一)双重荧光探针原位杂交方法(二)生物素和地高辛标记探针的双重原位杂交方法第八节原位杂交的PCR增敏法第九节原位杂交的CSA增敏法第十节原位核酸分子杂交的试剂一、特异性的探针试剂二、探针标记三、原位杂交信号的检测试剂四、成套原位杂交检测试剂盒五、如何选择原位杂交试剂原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(insituhybridizationISH)是应

4、用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特界性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞屮DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Genemapping),转基因检测,基因表达定位(localizationofgeneexpress

5、ion),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangementandtransportofmNA),复制(replication)和细胞的分类(Sortingofcells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenataldiagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定(biologicaldosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备，标记方法和基本操作方法的不断改进，新的技术不断涌现，相信在不久的将来，原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科，并不断为生命科学提供新的资料，开拓新的领域。第一节原位核

6、酸分子杂交技术的发展原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁屮。与此同时，BuongiornoNardelli和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。O「th(1970)应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA在细胞中的定位。由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学

7、者的重视和探索。Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer(1982)ffi道用2,4二硝基苯甲醛(DNP)标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的酶标抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酚组织化学的方法显示杂信号。Brigat(1983)首先建立生物素标记的探针在组织切片上检出了病毒DNA,通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞屮的定位，生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在