布鲁氏菌实时荧光定量pcr检测方法与血清快速诊断试纸的初步分析

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1、布鲁氏菌荧光定量PCR检测及血清学快速试纸的初步研制引言布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患慢性传染病。布鲁氏菌是革兰氏阴性胞内寄生菌，能感染许多种动物和人。目前，根据致病性及宿主的不同将布鲁氏菌分成6个种，即马耳他布鲁氏菌(Brucellamelitensis)、流产布鲁氏菌(Br.abortus)、猪布鲁氏菌(Br.suis)、沙林鼠布鲁氏菌(Br.enotomae)、绵羊布鲁氏菌(Br.ovis)、犬布鲁氏菌(Br.canis)。其中在家畜中牛、羊、猪最常

2、发生，且可以由牛、羊、猪传染与人和其他家畜。本病对公众健康的威胁及对畜牧业造成巨大经济损失，引起世界各国的广泛关注，由此各国学者非常重视对布鲁氏菌诊断方法的研究。诊断布鲁氏菌病的方法通常包括病原学检测和血清学检测。然而细菌学检测虽然是诊断布鲁氏菌病的金标准，可是费时、操作条件严格并且具有一定的危险性。传统的血清学检测如琥红平板凝集试验（RBPT）、标准试管凝集试验（SAT）、2-巯基乙醇凝集试验（2-MET）、补体结合试验（CFT）等，容易在检测时与其它细菌间发生交叉反应，并且检测时操作和专业要求较严格。考虑到

3、上述问题，本实验也分别从布鲁氏菌的病原学和血清学检测方面进行研究。我们根据已报道布鲁氏菌特异的基因序列设计引物并合成，通过优化反应体系和条件，成功建立了布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法，该方法有较高的敏感性和特异性，为布鲁氏菌病的早期诊断、定量分析奠定了基础。同时本实验进行了检测布鲁氏菌血清学的胶体金免疫层析试纸条的初步研究。我们利用纯化的BP26蛋白做为检测线，以胶体金标记SPA为指控线制作胶体金试纸条，经研究证明该试纸条特异性、敏感性、准确性、稳定性良好。免疫层析技术是上世纪90年代初期发展起来的以胶体金为标

4、记物的简便、快速的检测方法，是一种把免疫亲和技术、印渍术和斑点的薄层层析技术组合在一起的新技术。由于用该层析条检测的时候，所有样品均经过较窄的纤维素膜的持续性反应，实际上对被测的物质起到浓缩、聚集作用，提高了反应的灵敏度，加快了反应速度，整个操作时间仅需3～15分钟。因此本试纸条检测在基层的推广使用上有广阔的前景。VII布鲁氏菌荧光定量PCR检测及血清学快速试纸的初步研制第一章文献综述布鲁氏菌外膜蛋白及检测技术研究进展布鲁氏菌（Brucella）也称布氏杆菌，是一种球状、球杆状或卵圆形的革兰氏阴性[1-3]菌，

5、根据病原性、宿主特性和表型特征的不同，1985年WTO布鲁氏菌病专家委员会将布鲁氏菌属分为6个种即马尔他布鲁氏菌(B.melitensis)、流产布鲁氏菌(B.abortus)、绵羊布鲁氏菌(B.ovis)、猪布鲁氏菌(B.suis)、犬布鲁氏菌(B.canis)和沙林鼠布鲁氏菌[4-5](B.neotomae)6个种。6种又有19个生物型：羊种菌（3个型）、牛种菌（8个型）、[6-7]猪种菌（5个型）、犬种菌、绵羊附睾种菌及沙林鼠种菌各一个型。从1994年开始，人们陆续从海洋动物包括海豚、小鲸鱼、海豹、及水獭

6、中分离到了第七种生物型的布鲁[8-10]氏菌，并且证明从海洋动物中分离到的布鲁氏菌的致病性和分子特征与上述已知6[11]种布鲁氏菌不同，是一种新的生物型布鲁氏菌。1布鲁氏菌外膜蛋白布鲁氏菌细胞膜是一个三层膜的结构，最内层的膜称为细胞质膜、外层膜称为外周胞质膜，最外层膜称为外膜。外膜与肽聚糖(peptidoglycan，PG)层紧密结合组成细胞壁，[12]外膜含有脂多糖(lipolpolysaccharide，LPS)、蛋白质和磷脂层，外膜的蛋白质也叫外膜蛋白(outermembraneproteins，OMPs

7、)。外膜蛋白在S型布鲁氏菌表面由于受到LPS的遮盖，不能充分暴露出来，R型布鲁氏菌表面缺少O链，OMP能够显露出来，所以[13]被视为是布鲁氏菌表面重要的保护性抗原。到目前为止，布鲁氏菌表面的主要OMPs有7类已被发现，根据分子量大小将它们[14-16]分为10、16.5、19、25～27、31～34、36～38和89kDa。其中25～27、31～34、36~38kDa是菌体表面最主要的外膜蛋白，25~27和36～38kDa主要存在于B.abortus细胞表面，31～34kDa在B.abortus细胞表面存在较

8、少，但却是B.meltiensis和B.suis细胞表面主要的OMPS。其中36~38kDa称为2组蛋白，是一种外膜的孔蛋白；25～27和31~34kDa称为3组蛋白，2组蛋白和3组蛋白以共价键的形式与细胞外膜的肤聚糖层紧[17-19]密结合。布鲁氏菌外膜蛋白的研究，对于布鲁氏菌的种型鉴定、遗传变异分析及布鲁氏菌病的免疫预防均具有重要意义，所以下面将几个主要的外膜蛋白做重点介绍。1.1