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时间:2019-02-28
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1、260/280260/230核酸在波长260nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 蛋白质由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处,在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上;DNA
2、的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。核酸的定量DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,它们的吸收高峰在260nm波长处,每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度,这些由分光光度计内预设的程序执行,因此,测试前选择正确的程序,测试样品的
3、类型,首先测试空白液,然后再测试样品,注意输入样品稀释倍数。如何避免吸光值漂移读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。核酸本身物化性质溶解核酸的缓冲液的pH值、离子浓度等在测试时,离子浓度太高也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液(如TE)可大大稳定读数。核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下(如10mMTris
4、-HClpH8.0),才能得到精确的检测结果。水的pH值不稳定,可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收,为了确保准确测量,请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。操作因素如混合要
5、充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。各波长具体含义及相关问题1. A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。DNA样品的A260
6、吸光度值是否>0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值<0.1);2. A280nm,A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比
7、值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。4.A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。5.A260/A280和A260/A230是核酸纯度的指示值。
8、纯度好的DNA或RNA,在pH7-8.5下A260/A280的比值应该在2.0或2.5。纯净的样品比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。当0.5%BSA蛋白质污染时,蛋白污染会导致260和280的数值都下降
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