日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究

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1、万方数据指导小组成员：胡薇教授鞠川杨忠副教授万方数据复旦大学硕士毕业论文～一一日本血吸虫入侵宿主过程中关键尾蚴蛋白酶的研究摘要血吸虫病是一种由血吸虫侵染人类及其它哺乳动物引起的人畜共患寄生虫病，在我国流行的是日本血吸虫病。目前还没有预防血吸虫病的有效方法，而唯一的有效治疗药物吡喹酮已经出现耐药性，因此亟待开发预防和控制血吸虫病的新方法。血吸虫以尾蚴的形式入侵终宿主，进而对宿主造成严重危害。在侵染过程中，尾蚴分泌的蛋白酶发挥了主要作用，研究血吸虫入侵宿主相关的尾蚴蛋白酶有助于揭示血吸虫侵染宿主分子机制和预防血吸虫病

2、。本文对日本血吸虫入侵宿主相关的尾蚴蛋白酶进行了深入研究。【方法】首先对日本血吸虫尾蚴可溶性总蛋白和尾蚴分泌蛋白分别进行质谱分析，筛选其中可能与血吸虫入侵宿主有关的尾蚴蛋白酶：然后对组织蛋白酶B2(SjCB2)、尾蚴弹性蛋白酶(SjCE2b)、钙蛋白酶(Sjcalpain)、金属内肽酶(SjME)、M17家族氨基肽酶(SjMl7)、线粒体金属肽酶M16(SjMl6)和蛋白酶体B型7亚单位(SIP7)七种日本血吸虫尾蚴蛋白酶基因进行了原核克隆表达及纯化；将纯化的重组蛋白分别免疫新西兰白兔制备兔多克隆抗体并用ELIS

3、A检测多克隆抗体的效价：利用免疫荧光定位技术观察SjCB2、SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴组织中的分布情况；通过麦胚无细胞表达体系表达可溶性的重组SjCB2和SjCE2b蛋白，分别测定无细胞表达产物、尾蚴可溶性抽提总蛋白和尾蚴分泌蛋白中SjCB2和SjCE2b的酶活性；我们还利用蛋白酶特异性抑制剂在小鼠体内分析了SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain在日本血吸虫入侵过程中的作用。【结果】质谱分析结果表明，尾蚴可溶性抽提总蛋白鉴定出685种蛋白，而尾蚴分泌蛋白鉴定出59种；成功实现了SjCB2，SjC

4、E2b，Sjcalpain催化活性位点片段和cE+结合位点片段，SjME，SjMl7，SjMl6和SjP7的原核表达，相对分子质量(尬)分别约为65KDa、31KDa、43KDa和39KDa、50KDa、60KDa、51KDa和34KDa，均与预期大小一致，组氨酸标签亲和层析成功纯化得到8种目的重组蛋白；间接ELISA结果显示纯化蛋白对应的多克隆抗体效价均超过1：80000；免疫定位结果显示，sjcB2，SjCE2b和Sjcalpain均主要分布在日本血吸虫尾蚴头部；酶活测定结果显示，无细胞表达产物、尾蚴总蛋白和

5、尾蚴分泌蛋白中均显示出较高的研CB2和SjCE2b蛋白酶活性；尾蚴侵染抑制实验中，尾蚴与sjcm特异性抑制剂，SjCE2b特异性抑制剂，Sjcalpain特异性抑制剂和SjCE2b兔多抗孵育后感染小鼠，减虫率分别为48．O％、33．3％、17．4％和27．2％。【结论】SjCB2，SjCE2b和Sjcalpain在尾蚴中均有较高的丰度且主要分布于尾万方数据2复旦大学硕士毕业论文蚴头部，体内抑制剂实验结果表明sjcB2、SjCE2b和Sjcalpain三种蛋白酶均参与了日本血吸虫尾蚴入侵宿主皮肤的过程。综上所述，本

6、研究利用蛋白酶学、分子生物学以及免疫学等方法对日本血吸虫入侵宿主相关尾蚴蛋白酶的功能进行了深入研究，研究结果为日本血吸虫侵染分子机制的揭示提供理论基础，并为研发抗血吸虫病的疫苗和药物提供了新线索。关键词：日本血吸虫；入侵宿主；尾蚴蛋白酶中图分类号：R383．24万方数据ThestudyofkeycercarialproteasesofSchistosomajaponicuminhostskininvasionAbstractSchistosomiasisisaparasiticzoonosiswhichcause

7、dbyschistosomesandposesgteatthreattothehealthofhumanandothermammals．SchistosomajaponicumisthemajorpathogenicorganismofschitosomiasisinChina．Nowadays，duetotheabsenceofvaccines，thetreatmentofschistosomiasisstilldependsalmostexclusivelyonpraziquantel，butstudiesh

8、aveexhibitedpotentialanti．schistosomalpropertiesforthisdruginthelaboratory．Thus，itisurgenttoexplorenewwaystopreventandcontr01schitosomiasis．Schistosomecercariaetakeskinpenetrationasaninit