不同产地柴胡的issr分子标记及品质研究

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1、湖北中医学院2O8届顾上：学位论文实验研究一、柴胡皂苷a、d的含量测定l仪器与试药1．1实验材料实验用样品共计9份(表1)，其中6、7、8、9号样品由中国医学科学院协和药用植物研究所(简称协和药植所)种植并鉴定，1、2、3、4号样品采集于保康GAP种植区并经种植区验收鉴定，5号样品由陕西天士力公司提供并鉴定。标本保存于湖北中医学院基础医学实验中心。样品照片见附录I(图中标尺每格为8cm)。各产地样品分别取其完整根部，40‘C干燥6h，粉碎，过二号筛(24目)，得供试药材粉末。表1实验材料及来源1．2仪器戴安Oionex高效液相色谱仪(P680四元泵，TCC-100柱温箱

2、，PDA一100检测器)，6．70Build变色龙色谱工作站。IJ-2001紫外检测仪(日本日立)AX一205十万分之一分析天平(瑞士梅特勒一托利多公司)7湖北中医学院208届颀Ij学位论文KQ3200B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)AYJl-1002-U微量有机型超纯水机(艾科浦)HHS型恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)1．3药品试剂柴胡皂苷a、d对照品(成都思科华生物技术有限公司，纯度>98％)，乙腈(天津市科密欧化学试剂开发中心，色谱纯)，甲醇(天津市标准科技有限公司，色谱纯)，氨水(武汉联碱厂，分析纯)，吡啶(上海振兴化工一厂，分析纯)，水为超纯水。2

3、实验方法的确定2．1紫外检测波长的确定文献报道n一1的检测波长有203nm、204nm、208nm、210nm，本研究称取柴胡皂苷a、d对照品5mg，精密称定，甲醇溶解，定容于5ml容量瓶中，配得柴胡皂苷混标溶液(柴胡皂苷a0．992mg／ml，柴胡皂苷d1．000mg／m1)。取上述混标溶液lml用甲醇稀释100倍，以甲醇溶液为对照，在紫外分光光度计上于190～300nm扫描，测得在204nm处有最大吸收(见图1)，因而确定其检测波长为204nm。1．5000．000rift图1柴胡皂苷a、d混标溶液uV吸收图8湖北中医学院208届硕l：学位论文2．2提取方法的考察中

4、国药典(2005)尚未收录柴胡的含量测定方法，文献中¨咱1多采用水浴回流提取或超声提取方法，故本实验选取某一产地样品分别采用超声法和加热回流法分别提取柴胡皂苷，以比较两法差别，方法如下。称取柴胡药材粉末0．59，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5％氨水甲醇溶液1Oral，称定重量，放置0．5小时，超声3小时(超声功率150w)，放冷，再精密称定重量，用甲醇溶液补足失重，摇匀后转移，4000r离心10min，倒出上清液，精密吸取5ml置于蒸发皿中，水浴挥去溶剂，用甲醇溶解定容至lml量瓶中摇匀，静置过夜，以一次性微孔滤膜(0．45um)滤过，得到供试溶液A。称取柴胡药材

5、粉末0．59，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入5％氨水甲醇溶液10ral，称定重量，70。C水浴加热回流3h，放冷，再精密称定重量，用甲醇溶液补足失重，摇匀后转移，4000r离心10min，倒出上清液，精密吸取5ml置于蒸发皿中，水浴挥去溶剂，用甲醇溶解定容至lml量瓶中摇匀，静置过夜，以一次性微孔滤膜(0．45um)滤过，得到供试溶液B。分别吸取供试溶液A，B各10“1，注入高效液相色谱仪，在204nm波长条件下记录供试溶液色谱图，比较色谱峰。结果显示，超声提取得到柴胡皂苷a峰面积94．0453，柴胡皂苷d峰面积96．7722。回流提取得到柴胡皂苷a峰面积92．88

6、06，柴胡皂苷d峰面积94．5350。两者无明显差别(见图2)。考虑到超声提取可在提取溶剂中产生空化效应和机械作用，有效地破碎药材的细胞壁，加速提取溶媒的分子运动，从而使有效成分溶出得更迅速和完全，且操作简便，故选用超声提取法。9湖北中医学院208届坝lj学位论文图2不同提取方法的比较2．3提取时间的考察比较超声提取法提取不同时间对色谱峰的影响[7-10l。结果显示，柴胡样品分别超声0．5，1，2，3h后的供试溶液中，超声1h比超声0．5h柴胡皂苷a，d峰面积均显著上涨，lh峰面积约为O．5h峰面积的1．45倍，而超声2h和3h柴胡皂苷峰面积基本稳定，分别为1h皂苷峰面

7、积的1．04倍和1．01倍(见图3)。由于超声lh柴胡皂苷已基本提取完全，故确定超声提取时间为1h。娶旧磐0．5hlh2h3h提取时问图3不同提取时间的考察+柴胡皂苷a一柴胡皂苷d2．4提取溶剂的考察柴胡皂苷a、d在提取过程中受酚类或酸性成分的影响，易使环氧醚键开环，而使含量降低，需使用弱碱性试剂提取，文献多采用甲醇、5％氨水甲醇或5％吡啶甲醇¨咱1，实验比较之。称取柴胡药材粉末0．59三份，精密称定，各置于具塞锥形瓶中，分别精密加入纯甲醇1Oml、5％氨水甲醇溶液1Oml、5％吡啶甲醇1Oml，超声提取1h，得到供试溶液C、D、E。分别