mir-199a在肾细胞癌中表达的临床意义及其对肾癌细胞生物学性状影响的实验研究

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1、南方医科大学2009级博士学位论文miR．199a在肾细胞癌中表达的临床意义及其对肾癌细胞生物学性状影响的实验研究TherelationshipofmiR-199aexpressioninrenalcellcarcinomabetweenclinicalfeaturesandtheeffectionofmiR-199aonbiologicalcharacteris“csofrenaIeelIcarcinoma课题来源：自选专业名称外科学泌尿外科学位申请人司彤指导教师刘春晓教授答辩委员会主席高新教授答辩委员会成员姚友生教授赵明教授论文评阅人姚友生教授郑少波教授李虎林教授2012年

2、5月3日广州博士学位论文miR-199a在肾细胞癌中表达的临床意义及其对肾癌细胞生物学性状影响的实验研究博士研究生：司彤指导教师：刘春晓教授第一部分摘要研究背景和目的肾癌是泌尿系统常见恶性肿瘤之一，是起源于肾小管上皮细胞的一种常见肾脏恶性肿瘤约占成人实体恶性肿瘤的20／0--3％，占肾脏原发恶性肿瘤的85％一90％。我国近年来肾癌的发病率和死亡率均有上升趋势。目前肾癌的发病原因还不是十分清楚，放化疗治疗效果不佳，虽然根治性的肾切除手术被认为是最有效果的治疗方法，然而进展期肾癌的5年生存率低于10％。肿瘤复发、转移仍是威胁患者生命的主要因素。肾癌的早期诊断较为困难，除影像学检查结

3、果外缺乏早期的实验室诊断指标，使得早期发现早期诊断及治疗具有一定的难度。最新的研究显示肾癌的发生发展与miRNAs之间存在密切的关联，有可能为肿瘤的早期诊断、预后判断及基因治疗提供新的途径。miRNA是由18--,25个核苷酸组成的单链小RNA，广泛存在于真核生物细胞中。它由DNA转录产生，但并不翻译成蛋白质，是一种非编码小分子RNA。miRNA广泛存在于真核生物在蛋白质合成中调节其他基因的功能。miRNA基因约站整个基因组的l％，miRNA通过与靶基因RNA的互补配对在转入后水平对基因表达进行调控，导致mRNA再降解和翻译抑制。miRNA与其靶mRNA分子组成了一个复杂的调控

4、网络，参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育、逆境应答等多种生物学过程。摘要miR．199a是高度保守的miRNA，在肝癌、宫颈癌、前列腺癌等多种肿瘤中表达异常，并可通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的改变而参与肿瘤的发生发展，其表达水平有可能作为多种肿瘤临床诊断、病理分型及其预后的标志。在肾细胞癌与mir-199a的发生、发展的研究鲜有报道本研究目的在于探讨mirl99a在肾癌组织及细胞中的表达改变及其对肾癌临床数据的影响，以期为肾癌的发病机制研究开辟新的领域，为mir-199a在肾癌的诊断、治疗及其早期防治领域的实践和应用提供实验依据。方法：1．Trizol法提取肿瘤与癌

5、旁组织总RNA，应用分光光度计法检测RNA浓度、纯度，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，使用实时定量RT-PCR(染料法)技术检测67例肾透明细胞癌患者肿瘤及瘤旁正常组织mir-199a的表达，分析表达的差异与临床病理特征等多种指标之间的关系。2．对肾癌细胞系Caki．1使用LipofectamineRNAiMAX瞬时转染模拟物(mimic)和miR-199a-5p。应用MTS检测细胞增殖，生长曲线；应用流式细胞仪检测比较转染后细胞周期分布变化、细胞凋亡变化；应用Transwell试验检测细胞迁移能力变化。统计学处理(二级标题)采用SPSSl7．0对实验结果进行统计学处理，计数资

6、料组间比较应用x2检验确切概率法，生存分析应用Kaplan-Meier法Logrank检验，多因素分析采用COX回归，实验室数据采用的方差分析，组内两两比较采用LSD法，检验水准为a=0．05。结果：1．在67例肾细胞癌和癌旁组织中miR-199a均有不同程度的表达，通过qPCR分析显示在肾细胞癌中47例miR-199a的表达低于癌旁正常组织，均值13．7倍。miR-199a的表达与肿瘤浸润程度和肿瘤复发成负相关(z2=4．215，P=O．040，)c2=6357，P=o．012)，而与年龄、组织学类型、淋巴结转移、远处转移、FuhrmaaⅡ博士学位论文分级等无统计学关联(贮=

7、o．557，P=0．312；z2=o．230，P=0．632；2c2=1．755，P=0．185；z2=o．171，P=0．680；z2卸．273，P=0．202)。miR-199a下调组生存期显著低于对照组(Log-ranktestz2=5．456，p=0．019)。2．通过转染miR．199a肾细胞癌株Caki．1，经qPCR检i9ltJmiR-199a转染细胞与NC组和cell组有显著差异。转染miR．199a，MTS、细胞生长、增值率显著降低，生长曲线斜率下降。流式细胞术检’狈tJm