伤寒沙门菌mig-14对基因表达的影响及相关功能研究

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1、分类号基墨2墨：2塑UDC鱼12硕士学位论文密级公五编号!Q22窆§!!!垒Q圣垒伤寒沙门菌Mig-14对基因表达的影响及相关功能研究RESEARCHoNTHEEl砸置CToFI咀G．14oNT日EGENEEXPRESSIONANDFUNCTIONIN眦MoNELLAENTERICASERO飞元ARTY聊作者姓名：张红指导教师：黄新祥教授小组成员：徐顺高副教授生秀梅副教授张海方副教授张盈讲师申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2014年4月28日论文答辩日期：2014年6月6日学位授予单

2、位：江苏大学学位授予日期：2014年6月答辩委员会主席：孙长贵教授独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：弓惨匀上啊，妒年参月／o日⋯⋯⋯权书f煳卿江苏大学、中国科学技术信息研究所

3、、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数据库》并向社会提供查询，授权中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生处办理。本学位论文属于不保密团。学位论文作者签名：酿让"-v'ot中年乡月／oH一

4、池1舀目沥力力殇胁：／p名年签妒币吖溯甲ET借江苏大学硕士学位论文摘要目的：Mig．14作为细菌中一种重要的调节因子，在沙门菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B的杀伤作用方面有重要作用，但其在伤寒沙门菌中的具体功能和机制还不清楚。本论文旨在研究Mig一14在伤寒沙门菌中的相关功能及其作用机制。方法：1．伤寒沙门菌的动力实验：从LB平板上用无菌牙签挑取野生株与mig-／,／缺陷株单菌落接种在O．3％的半固体LB平板上，37。C培养8h后，测量动力圈大小比较两者的动力。2．伤寒沙门菌对上皮细胞的侵袭力分析：将野生株与

5、mig-14缺陷株培养至对数期(OD600O．4)，加入培养有HeLa细胞的24孔板qb(MOI均为20)。培养90min后将部分孔的细胞破膜，收集菌体后涂板过夜，菌落数代表细菌粘附细胞水平(TO)；对另一部分细胞加入庆大霉素继续培养90min后，破膜涂板过夜，菌落数代表细菌侵袭水平(T90)，以T90／T0值代表细菌的侵袭力。3．伤寒沙门菌在'rRP-1细胞内生存力分析：将野生株与mig-14缺陷株培养至对数期(OD600O．4)，加入到有THP．1细胞的24孔板qb(MOI均为10)。培养1h后，加

6、入庆大霉素作用1h，将其中一部分孔的细胞破膜，收集细菌涂板，计数菌落数(TO)代表基础吞噬细菌水平；剩余孔内的细胞培养12或24h后，破膜收集细菌涂板，菌落数(T12或T24)作为细菌在胞内的增殖水平，T12／T0和T24／T0代表细菌在THP．1伤寒沙门菌Mig-14对基因表达的影响及相关功能研究细胞内的生存能力。4．多粘菌素B环境下细菌生长的观察：以生长时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制生长曲线，比较野生株与m／g-／∥缺陷株两者在多粘菌素B培养条件下的生长差异。5．qRT-PCR分析细菌基因表

7、达水平：将野生株与mig-14缺陷株在含多粘菌素B的LB培养基中培养5h，Trizol法提取总RNA，特异性逆转录后通过qRT-PCR分析两种菌株间的基因表达差异。6．Mig-14蛋白分段表达：构建pET22b(+)-mig-／4-p重组质粒，热击导入BL．21表达菌中，培养至OD6000．6后加入IPTG诱导细菌表达重组蛋白Mig-14-P，利用KCI染色切胶法纯化目的蛋白Mig一14一P，SDS．PAGE电泳鉴定目的蛋白纯度。7．Mig-14-．p抗血清的制备：将重组蛋白Mig-14一P与等体积的弗

8、氏完全佐剂研磨乳化后，于兔子背部皮下注射1mL，21天后，用Mig一14-P与弗氏不完全佐剂研磨形成的乳化抗原同样免疫家兔，此后每隔10天加强免疫一次。ELISA检测抗体效价达到104以上时终止免疫，并用免疫印迹法测定抗血清的特异性。8．免疫共沉淀实验：收集伤寒沙门菌野生株在高渗(30min)和多粘菌素B(30min)条件下的细菌总蛋白，利用自制的抗Mig．14一P的抗血清进行免疫共沉淀实验，探究是否存在与Mig．14相互作用的蛋白。9．凝