苏云金杆菌高效菌株的筛选及固体发酵研究

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1、河北农业大学硕士学位论文苏云金杆菌高效菌株的筛选及固体发酵研究姓名：刘云飞申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：陆秀君20120529摘要苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是目前应用最广研究最深入的生防微生物。但是Bt制剂在应用过程中仍存在杀虫谱窄、抗逆性差、防治成本偏高等缺点，限制了其进一步扩大应用。为了得到具有应用潜力的自然菌株，本实验室利用分子鉴定的方法，前期筛选得到两株基因型丰富的苏云金杆菌野生菌株BtCYZ_4和BtS—19，通过基因型分析，预测其可能为杀虫广谱的野生株。本研究利用生物测定方法系统研究了两菌株对7种常

2、见农林害虫和卫生害虫的毒力及对紫外线和高温等不良环境条件的抗逆能力，同时，对Bt与化学药剂的协同作用方式进行了探索实验。得到了杀虫谱广、抗逆性强的BtCYZ-4菌株，为了降低生产成本，对BtCYZ-4菌株的低成本固体发酵技术进行了系统研究；得到以下主要结果：1．两菌株杀虫广谱，但因基因型不同对不同害虫活性表现出差异。室内生物测定结果表明，BtCYZ4菌株对粘虫(Mythimnaseparata)初孵幼虫48h的LC50为6．6x106cells／mL，对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、淡色库蚊(Culex

3、pipienspaliens)初孵幼虫和美国白蛾(Hyphantriacunea(Onw)、苹掌舟蛾(P^aleraflavescens)、杨扇舟蛾(Closteraanachoreta)二龄幼虫72h的LC50分别为4．7×106cells／mL、2．25x105eells／mL、2．01x10’cells／mL和2．9×106cells／mL、6．6x107cells／mL、1．7x106cells／mL；相同处理的BtS．19菌株对上述害虫的LC50则依次为3．1×107cells／mL、9．0x106cells／mL、4．1×104cells／mL、3．5×1

4、04cells／mL和1．8×105ceUs／mL、1．7×106cells^nL，对杨扇舟蛾活性较差，这两株菌对美国白蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾和淡色库蚊均表现出了很强的杀虫活性。BtCYZ_4菌株对粘虫、棉铃虫、杨扇舟蛾和苹掌舟蛾的活性高于Bts．19菌株，而对美国白蛾、甜菜夜蛾和淡色库蚊则表现了相反的趋势。2．BtCYZ-4菌株抗逆性优于BtS．19。研究了温度，紫外线处理不同时间两菌株对美国白蛾幼虫活性的变化。分别采用30。C，33℃，37℃，42℃温度梯度处理及30rain，60min，120rain，180rain，240rnin年11360min不同处理时间，

5、结果表明两株菌在高温处理下，随着温度的升高和处理时间的延长，活性均呈现出下降趋势。但BtcYz_4抗高温的能力明显高于Bts．19；两菌株紫外线处理随着照射时间的延长，杀虫活性也均明显降低，BtcYz4经紫外线照射6h，二龄：美国白蛾幼虫平均校正死亡率为56．7％j活性降低了40％。BtS．19经紫外线照射6小时，二龄美国白蛾幼虫平均校正死亡率为13．33％，活性降低了81．67％。说明BtCYZ4{抗紫外线能力明显高于BtS．19；综合而言，BtCYZ一4菌株抗逆性优于BtS．19，应用潜力较大。3．得到了以玉米淀粉和玉米芯为基质的BtCYz_4菌株低成本固体发酵配

6、方。参考LB培养基C源、N源和矿质元素的组成及比例，通过单因子优化和正交试验，得到了以玉米淀粉为碳源的固体发酵配方，各成分含量为：玉米淀粉1％、氮源A0．5％、氮源B2％、酵母粉0．1％、K2HP040．075％、MgS04O．035％、CaC03O．05％。利用此培养基，按照4％接种量，30℃发酵培养6d，孢子浓度可达到5×109celIs／mL；在上述矿质元素含量，接种量，pH不变的情况下，30℃发酵培养6d，以单一玉米芯为培养基质发酵培养BtCYZ-4菌，含水量为70％时孢子浓度最大。以玉米芯、氮源A和氮源B为基质，按玉米芯7．29、氮源A39、氮源B3．29、

7、蒸馏水23．39时孢子浓度最高，可达到1．6×10m个僮。上述两配方发酵产物浓度优于文献报道的固体发酵水平。4．苏云金杆菌BtS．19与高效氯氰菊酯协同作用方式为Bt预处理。采用Bt预处理及直接混用2种方式施药，室内饲毒法测定了2种药剂对美国白蛾2龄幼虫的活性。结果表明：试虫先用每mL含l×106个／mL孢子的BtS．19菌悬液预处理，1d后再用系列浓度的高效氯氰菊酯处理，其48h的LC50值为O一76mg／L，而未经预处理，仅用高效氯氰菊酯处理48h的LC5I)值为1．28mg／L；2种处理在高效氯氰菊酯质量浓度为2．25mgm时对试虫的半致死时间