鱼类卵黄蛋白原调理作用的分析

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1、鱼类卵黄蛋白原调理功能类型的研究鱼类卵黄蛋白原调理作用研究{两裴硬骨鱼类虽然具有和高等脊椎动物相似的免疫系统，但作为低等脊椎动物，其特异性免疫机制尚不完善，非特异性免疫占据更为重要的地位。在非特异性免疫中，吞噬细胞在鱼类抗感染免疫中发挥核心作用。一些能与抗原结合并促进吞噬细胞吞噬功能的物质称为调理素；通过结合调理素辅助吞噬作用的现象称为调理化。目前，已经发现的调理素主要有补体活化成分C3b及IgG类抗体。新近，Li等人(2008；2009)的研究表明鱼类卵黄蛋白原(Vitellogenin，V曲也能发挥调理素的功能。然而，关于V

2、g参与调理作用的机理完全不了解。本论文主要目的就是研究Vg的调理作用类型与机理。本论文首先利用Percoll密度梯度离心法从鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)头肾中分离纯化得到了巨噬细胞，并对其噬菌功能进行了鉴定。通过吞噬实验统计两个参数——吞噬能力衅)和吞噬指数(PD来评价巨噬细胞的噬菌水平，发现鲈鱼头肾巨噬细胞和酵母作用90min时吞噬能力可能达到最大值。然后，用鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬与六线鱼(HexagrammosotakiOVg孵育过的酵母，结果发现，与对照相比，经Vg处理的实验组的PA和Pl都有显著性提高(

3、胙0．05)，说明Vg的调理素功能不具有种属特异性。利用六线鱼Vg可以促进鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬作用这一系统，接着我们证明了Vg调理功能可被lavendustin(蛋白酪氨酸激酶PTK的特异性抑制剂)、PPI(蛋白酪氨酸激酶FIK的特异性抑制剂)和staurosporine(蛋白激酶CPKC抑制剂)所影响；但不受nocodazole(微管抑制剂)和C3exoenzymefRhoGTPases抑制剂)的影响，说明Vg的调理功能可能属于I型机制。由于巨噬细胞I型调理是由巨噬细胞膜表面受体FCYRs介导，激发吞噬信号传导通路。接下来，我

4、们进一步验证Fc丫Rs是否参与了Vg的调理。我们用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的FcY黜三类受体的单克隆抗体F吖RJ、Fc丫Rn和F吖RIII与鲈鱼巨噬细胞孵育，荧光显微镜观察发现这三种单克隆抗体均可以与巨噬细胞结合，表明巨噬细胞表面存在F吖刚、FcyRII和FcTRIII这三种受体。在此基础上，我们进而用这三种单抗对巨噬细胞表面相应受体进行封闭，检测受体封闭对Vg的调理功能的影响，结果发现，与对照相比，受体封闭能不同程度地抑制巨噬细胞吞噬Vg孵育过的酵母，说明Vg可能通过与FcTRI、FcTRII和FcTRlH这三种受体鱼类

5、卵黄蛋白原调理功能类型的研究结合介导调理过程。我们还对蛋白质酪氨酸激酶Sky和P13．激酶是否参与Vg调理过程进行了研究。用蛋白质酪氨酸激酶Sky和P13．激酶各自的特异性抑制剂piceatannol和wortmannin对鲈鱼巨噬细胞进行处理，通过realtimePCR的方法检测Vg调理后炎症因子TNF—a和IL．1p基因表达量的变化情况，结果发现，与对照相比，抑制剂处理组的TNF．Q和IL．1p表达量有显著性下降(砰O．05)，说明蛋白质酪氨酸激酶Sky和P13．激酶可能参与Vg调理过程的信号传导，影响炎症因子的产生。总之，

6、本文首次证明了鱼类Vg诱导的吞噬作用属于I型调理吞噬作用。经典的I型调理吞噬作用主要由lgG抗体诱导，后来发现CRP诱导的吞噬作用也属于I型调理吞噬作用。这说明Vg和CRP一样在诱导吞噬方面具有类抗体功能。关键词：鲈鱼；卵黄蛋白原；巨噬细胞；Fc),Rs；I型调理▲／t；StudyonopsonicactivityoffishvitellogeninAbstractBonyfishhaveaimmunesystemsimilartothatofhighervertebratesincludinghumans．However,as

7、lowervertebrates，theirspecificimmunemechanismisnotperfect，buttheirnon-specificorimmateimmunityiswell—developed．Amonginnateimmunityoffishphagocytesincludingmacrophagesplayacentralroleinanti．infectionimmunity．Somemolexculeswhichcanbindantigennadpromotethemacrophagephag

8、ocytosisiscalledopsonin，andtheprocessbywhichtheopsoninenhancesphagocytosisisnamedopsonization．Themajoropsoninsfoundinserumsofararei