细菌计数培养方法探讨

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1、细菌计数培养方法探讨韩静1张景旭1李岩21.承德市中医院河北承德067000；2•丰宁县第二医院河北承德067000【摘要】目的：了解医院环境监测细菌计数时直接表面接种和倾注法检测结果的差别，为准确做好院感环境检测提供简单、可靠的方法。方法：用兼性厌氧的大肠埃希菌、专性需氧的铜绿假单胞菌和物体表面常见细菌的菌液，以表面定量接种和倾注法做菌落计数。结果：培养皿表面定量接种培养约24小时后，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌落牛长都很典型检测结果为170和205。培养48小时数量没变化菌落略大。倾注法定量接种培养约

2、24小时后，大肠埃希菌菌落牛长典型的为13,不典型菌落15&培养48小时候变为52,119；铜绿假单胞菌菌落生长典型的为8,不典型菌落192；培养约48小时后，生长典型的为26,179o随机擦拭100cm2消毒前物体表面到5毫升牛理盐水中，育•接表面接种50ul培养24小时后测得细菌数量为15cfu/cm2,倾注法得到10cfu/cm2；48小时后分别为15cfu/cm2和13cfu/cm2o结论：定量表面直接接种法更适合物体表面和各种液体标木中的细菌计数。【关键词】环境监测；细菌；菌落计数【中图分类号

3、1R115【文献标识码］B【文章编号】1674-8999(2015)8・0442-02为了提高医疗安全，医院环境细菌学监测内容越来越得到重视，其中消毒液染菌量、透析液中细菌含量及各类物体表面细菌数量监测是最常见的检测内容。这类监测一般采用琼脂倾注法⑴检测，在实际工作中发现倾注法检测结果偏低切菌落计数时菌落辨认常常比较困难。为此我们采用了琼脂表面直接接种法，结果收到良好效果。1材料1.1菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC259231.2营养琼脂杭州天和出品2方法2.1菌液配制上述不同细

4、菌的纯培养菌落配成0.5麦氏单位菌液，按细菌数量为每毫升108计算进行稀释，将细菌含量稀释到每毫升约5000后用于实验。2.2直接接种每种细菌各取lOOuk50ul、25uk10ul分别接种配制好的营养琼脂表面，用接种环密涂后，送36°C；空气条件下培养。2.3倾注接种每种细菌各取lOOuk50uL25uK10ul分别加入无菌的90mm空皿中，将高压灭菌后冷却到约50°C的营养琼脂适量20-25ml倾入培养皿，按一个方向轻轻旋转使菌液和营养琼脂混合均匀，待琼脂凝固后送入培养箱培养。2.4菌落计数培养约2

5、4小时取出平皿计数各自的菌落数，计数完毕立即送冋培养箱继续培养隔夜后再计数一次。计数结果分易辨认和不易辨认分别计入。以没有菌落融合且可以分辨菌落较多平板作为计数用。3结果培养皿表面定量接种培养约24小吋后，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌落生长都很典型检测结果为170和205。培养48小时数量没变化菌落直径略大。倾注法定量接种培养约24小吋后，大肠埃希菌菌落生长典型的为13,不典型菌落158；培养48小吋候变为52,119；铜绿假单胞菌菌落生长典型的为8,不典型菌落192；培养约48小吋后，生长典型的为26,

6、179o经统计学处理两种检测方法大肠埃希菌计数无显著性差别p>；0.05；铜绿假单胞菌差别显著P<0.001o随机擦拭100cm2消毒前物体表面并转到5毫升生理盐水中，直接表面接种50ul培养24小吋后测得细菌数量为15cfu/cm2,倾注法得到10cfu/cm2；48小时后分别为15cfu/cm2和13cfu/cm2o两种方法存在显著性差别P<0.001o4讨论细菌计数是细菌学检验经常遇到的常规工作【2,3,4,5】。细菌计数方法一般采用生长菌落计数法，生长菌落计数法中-•般采用琼脂表

7、面直接密涂接种和倾注接种法两种。密涂法接种优点是只要有制备好的培养基可随吋立即接种，不仅方便还省时省力；缺点是接种的液体量不能过大，一般直径90mm平皿超过100ul液体标本，琼脂表面干燥变得困难。倾注法优点是液体标本接种量可以比较大，适合液体中细菌比较少的标本；缺点是培养基般要现用现配不仅操作繁杂，温度控制也必须很严格才不至于把接种的细菌烫死和琼脂温度过低而无法和标本充分混均影响计数。从本文结果看表面直接接种不仅菌落典型、操作方便、计数也很准确。理论上象铜绿假单胞菌这类的需氧菌倾注法计数应该低于直接表

8、面接种，可能是通常琼脂厚度不算厚未有能明显阻止其生长。既然表面接种优点多，如何克服其接种量少和细菌不均匀成了主要问题。物体表面细菌数要求最严格的一类环境为小于等于5cfu/cm2,采集100cm2面积，转入5毫升盐水或中和液中，如果接种50ul,细菌生长的数量为每平方厘米物体表面的细菌数。消毒液染菌量和这个差不多，也能满足需要。其实如果真的需要做更精密的计数可以通过离心沉淀浓缩后接种或增加采样面积或适当减少中和液体积即可。表面接种相应手续简