红细胞凝集试验检测狂犬病毒g抗体方法的建立及应用

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1、广西大学硕士学位论文红细胞凝集试验检测狂犬病毒G抗体方法的建立及应用姓名：周松峰申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：陆芹章；吴健敏20120630红细胞凝集试验检测狂犬病毒G抗体方法的建立及应用摘要狂犬病是由狂犬病病毒(rabiesvirus，RV)引发的一种人兽共患传染病，几乎感染所有的温血动物和人，能引起急性致死性脑脊髓炎，一旦发病，病死率几乎100％，是迄今为止，病死率最高的急性传染病，已经成为严重危害公共卫生的重大疫病。目前，尚无有效的药物和方法治疗狂犬病，主要以免疫为主，免疫后能否产生有效的保护抗体，建立一种行之有效的狂犬病抗体检测方法进

2、行检测十分重要，另外也可以通过抗体检测进行狂犬病诊断和疫苗评估。为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白，本试验设计出两对特异性引物，从重组质粒pMD-G和pMD一2E8ScFv中分别扩增出Kg基因和2E8基因，通过SOE-PCR方法法拼接成融合基因2E8Kg，进一步构建原核表达质粒pET—Trx一2E8Kg，后转入BL21(DE3)plysS中诱导表达。SDS—PAGE分析表明，2E8Kg融合基因获得了高效表达并主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的23．5％左右，分子量约为77．7kD，与预期大小一致。将表达的蛋白以亲和层析法进行纯化并通过谷胱

3、甘肽还原法进行复性，纯化后蛋白纯度达到98．9％。经Western—blot检测和红细胞凝集试验证明，2E8Kg融合蛋白既能够与狂犬病毒(Rv)高免血清发生特异性反应，又能够与人红细胞结合，具有双功能特性。以此双功能融合蛋白为检测抗原，以人‘0’型红细胞作为指示细胞，建立了快速检测狂犬病毒G抗体的方法。通过方阵滴定试验筛选出检测抗原最佳稀释度为1：16，对应的工作浓度为106．26lag／mL，血清最佳稀释度为1：16，作用时间25min。利用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)阳性血清均无凝集，。与Rv标准阳性血清反应出现强凝集，表明该方

4、法特异性强。用不同批次制备的检测抗原重复检测狂犬病毒阳、阴性标准血清，检测结果完全一致，具有很好的重复性。将红细胞凝集试验与荧光抗体病毒中和试验(FAvNT)作平行比对，通过对临床1086份犬血清的检测，结果发现血凝价大于或等于1：16(相当于FAVNT试验中和效价O．5IU／mL)为免疫抗体合格，两种检测结果的符合率为89．2％。本研究利用双功能融合蛋白建立的检测犬狂犬病抗体红细胞凝集试验诊断方法，操作简单、灵敏度高且特异性强，可以用于犬狂犬病抗体的检测、疫苗免疫效果评估，满足了基层快速、简便、可现场使用的要求。关键词：狂犬病毒抗人红细胞单链抗体双功能融

5、合蛋白红细胞凝集试验T耻DEVELoPM哐NTANDAPPLICATIoNoFERymoCYTEAGGLI删A=noNASSA蜘FoRDETECTIoNoFTHEGANTmoDYToRABIESV删SABSTRACTRabiesisazoonosiswhichsymptomsforacutefatalencephalomyelitiscausedbyrabiesvirus(rabiesvirus，RV)infectionofthecentralnervoussystemofwarm-bloodedanimalsandhuman,andalmostallwa

6、rm-bloodedanimalsareeasytobeinfected，Oncethediseasebreakout,itsmortalityrateisalmost100％，thatisoneofthehighesthumanfatalityrateofacuteinfectiousdiseases，ithasbecomethemajorepidemicsofseriousharmtopublichealth．Whilethereisnoeffectivemedicinefortreatingrabiesexceptformainlyfocusingo

7、npreexposureandpostexposureimmunization，SOtheeffectivediagnosisofpre—exposureandmonitoringwhethertheeffectiveprotectiveantibodyisproducedafterrabiesvaccinationornot，besidesdevelopingvaccineeffectivenessassessmentareveryInordertoconstructfusionproteinsthatc趾generateagglutinationand

8、immunereaction，specificprimerswer