hcv蛋白ns5a在胰岛素信号通路中的作用

《hcv蛋白ns5a在胰岛素信号通路中的作用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、硕士学位论文HCV蛋白NS5A在胰岛素信号通路中的作用硕士研究生：罗丹萍指导教师：姜泊教授摘要研究背景丙型肝炎病毒(HepatitisCvirus，HCV)是一种主要经过血液传播的嗜肝性病毒，其慢性感染可引起慢性丙型肝炎，进而可导致肝硬化或肝细胞癌。据WHO统计，全球丙型肝炎病毒(HCV)感染者约1．7亿(感染率约为3％)，我国HCV感染率为3．2％，且感染率仍有逐年上升的趋势。然而HCV感染治疗的手段有限，主要依靠a．干扰素，及以仅．干扰素为主体再附加其他辅助手段。目前也还没有有效疫苗，使得HCV感染成为一个重要的社会问题

2、。尽管科学研究受到广泛的重视，但HCV感染的分子机制还有许多不清楚，从而影响了临床丙肝病毒感染的治疗手段的发展。HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属。HCV编码多个结构蛋白和非结构蛋白，其中NS5A是一个重要的非结构蛋白。它有两种磷酸化形式：p56和p58，它们均可以与宿主内多种信号蛋白发生作用。近来的研究发现NS5A与胰岛素信号通路(Insulin／P13K／Akt通路)之间存在关联。而胰岛素信号通路在细胞代谢、细胞周期调控、细胞生长凋亡等多种生物学过程中发挥着重要的作用。这意味着NS5A可能通过改变胰岛素信号通路，从而在HCV

3、感染过程中发挥其作用。在正常情况下这条信号通路受到严格的调控，其稳态的变化与不同疾病的发生相联系。当Insulin／P13K／Akt信号通路中的关键分子P13K(调节亚基p85和催摘要化亚基pl10)、Akt等编码基因的功能发生改变，可导致细胞代谢障碍【2-3】、细胞周期及细胞生长凋亡紊乱而引起各种疾病，例如肿瘤。HCV蛋白NS5A可结合并激活P13K，导致下游分子丝氨酸／苏氨酸激酶，即Akt／蛋白激酶B的激活，破坏了信号通路在体内的稳态，导致HCV感染的细胞持续增殖而引发一系列病理效应，包括抗病毒抗性的产生f4羽、肝细胞癌

4、发生等【6‘7l。PTEN是除p53之后一个重要的抑癌基因。该基因功能的降低与多种组织的肿瘤发生有关。曾有研究报道丙肝导致的肝癌中，PTEN的功能降低。而PTEN是胰岛素信号的主要负调节因子，抑制Insulin／P13K／Akt信号，从而与HCV激活Insulin／P13K／Akt信号作用相对抗。本论文研究了抑癌基因PTEN与细胞胰岛素信号通路稳态的关系，及HCV蛋白NS5A对细胞胰岛素信号通路稳态的破坏作用，显示了PTEN与NS5A从正反两个方面影响胰岛素信号通路，通过改变该信号通路的稳态，从而影响细胞的命运。第一部分PT

5、EN对lnsulin／P131(JAkt信号通路稳态的作用l目的l既然，丙肝肝癌中，PTEN的功能减弱。因此，我们首先研究PTEN与Insulin／P13K／Akt稳态的关系。我们以人肝癌细胞系HepG2为研究模型，用胰岛素刺激、或上调或沉默PTEN的表达等，利用Westernblot技术，从蛋白水平层面研究Insulin／P13K／Akt信号通路的稳态变化。【方法ll、常规培养HepG2细胞传代均匀铺十二孔板，待长至约90％后，予血清饥饿24小时后裂解细胞。裂解细胞前予insulin刺激10min(胰岛素工作浓度为2ul／

6、ml，用无血清DMEM液稀释)或加入同体积的无血清DMEM培养液作对照，分为insulin刺激组或control组，裂解细胞提取总蛋白，Westemblot蛋白分析法检测p-Akt蛋白表达水平。2、常规培养的HepG2细胞根据转染携带人野生型PTEN的真核表达质粒(pSvEGFP．PTEN)或磷酸酶域突变型质粒pSvEGFP．C124S两种不同质粒分为II硕士学位论文两组，即PTENwt组及PTENCl24S组，转染、血清饥饿同上。两组均予等量等浓度胰岛素刺激10min后裂解细胞，提取总蛋白。Westernblot蛋白分析检

7、测P．Akt蛋白表达水平。3、常规培养的HepG2细胞根据转染PTENsiRNA及其controlsiRNA分为两组，即PTENsiRNA组及control组，转染、血清饥饿及胰岛素刺激同上。转染共48小时后常规裂解细胞，提取总蛋白。Westernblot蛋白分析法检测PTEN及P．Akt两种蛋白表达水平。4、所有结果经Excel2010及SPSSl3．0统计软件分析，数据以“算术平均值4-标准误(M+S．E．M)”表示。两组间比较采用独立样本t检验(Independent．SamplesTTest)或两个独立样本比较的Wi

8、lcoxon秩和检验，以P值<0．05视为有显著性差异。l结果】l、Westernblot检测结果显示insulin刺激组较control组P．Akt蛋白表达水平显著提高(P