乙肝核心抗原原核表达和纯化的初步的研究

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1、温州医学院硕士学位论文乙肝核心抗原原核表达与纯化的初步研究中文摘要目的：构建pET28a(+)一HBcAg重组基因的原核表达载体，将重组子在E．coliRosetta(DE3)中进行诱导表达，利用镍螯合琼脂糖凝胶柱分离纯化HBcAg蛋白，为进一步研究其蛋白活性、试剂盒的研发以及乙型肝炎核心抗原作为载体呈递外源表位及其疫苗的研制奠定一定的基础。方法：1、pET28a(+)一HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达采用PCR方法，以含HBcAg基因的克隆质粒为模板，扩增基因HBcAg并将其克隆入原核表达载体质粒pET28a(+)中，构建成表达载体pET28a(+)一HBcAg,菌落PC

2、R、限制性内切酶双酶切和测序鉴定重组质粒的构建是否正确。将表达质粒转化E．coliBL21和E．coliRosetta(DE3)，经IPTG诱导其表达，通过SDS．PAGE和免疫印迹分析表达产物。2、以镍琼脂糖凝胶FF进行全菌中HBcAg蛋白的纯化将主要以包涵体形式表达的蛋白质的全菌，用Buffer溶解，超声破碎后以镍琼脂糖凝胶FF纯化产物HBcAg，通过SDS．PAGE和免疫印迹进行分析纯化产物。结果：1、原核表达载体的构建和表达菌落PCR、双酶切鉴定分析以及测序结果分析表明原核表达载体pET28a(+)一HBcAg与设计相符；工程菌Rosett“DE3)／pET28(+)-HBc

3、Ag诱导表达后在分子量为21KDa处可产生特异的表达条带，并能够被抗鼠IgG单克隆抗体所识别，蛋白分子量大小与预期相一致。2、表达细菌中的HBcAg蛋白的纯化全菌蛋白经以镍琼脂糖凝胶FF柱，电泳检测HBcAg蛋白纯化度，纯化度约达90％；抗原性经免疫印迹分析表达产物表明，其免疫原性尚佳。结论：本课题中，我们通过基因过程的方法，成功的构建了原核表达载体pET28(+)一HBcAg，镍琼脂糖凝胶FF柱分离纯化得到了较纯的HBcAg蛋白，为进一步研究HBcAg蛋白的结构，试剂盒的开发及其蛋白活性及乙型肝炎核温州医学院硕士学位论文心抗原作为载体呈递外源表位及其疫苗的研制奠定一定的基础。关键词

4、：乙型肝炎；HBcAg；原核表达；包涵体2——一温州医学院硕士学位论文～——————————————————————二——二二—二二二一二-～一ExpressionandPurificationofHBVCoreRecombinationProteininEscherichiacoliABSTRACTObjectiveToconstructaprokaryoticexpressionvectorforHBcAgrecombinaftongene，toexpresstherecombinationgeneinE．coliRosetta(DE3)，andpurificationwithN

5、isepharoseFF，PreliminarilyevaluatethebioactivitiesofHBcAg，developmentforHBcAgkit，delivertheexogenousantigenepitoDeandforthefurtherresearchofvaccine．Methods1、ThegenefragmentofHBcAgwasamplifiedbyPCRfromplasmid,andthenwasenzymedbyEcoRIandHindIIIandwasinsertedintopET28ar+1．TherecombinantofpET28a(+)

6、一HBcAgexpressionvectorwastransformedintoE．coliRosetta(DE3)andinducedtoexpressbyIPTG．．ThepET28a(+)．HBcAgisdesignedforexpressionofrecombinantproteinfusedtothe183aminoacidthioredoxin(21kDa)，a6aminoacidHis．tag．Thefusiontagstogethercanberemovedfromtherecombinant-：targetproteinbyproteasecleavageusing

7、enterokina2、PurifiedtheHBcAgfromthewholebacteriaTheHBcAgrecombinantproteinfromthewholebacteriawaspurifiedbyNi—agarosegelFF，thepurificationnearlyupto90％．AnalysistheproductbySDS．．PAGEandWestern—Bloting．ConclusionWesuccessfullyconstr