钩藤碱抗苯丙胺依赖作用的实验研究

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1、硕士学位论文钩藤碱抗苯丙胺依赖作用的实验研究硕士研究生：周吉银指导教师：莫志贤摘要背景：苯丙胺类中枢兴奋剂流行性滥用造成了严重的社会危害，对其干预是防治药物依赖的一个新课题。对苯丙胺依赖形成机制研究有待进一步深入。中药钩藤已在许多戒毒复方中使用，但其主要活性成分钩藤碱对苯丙胺类依赖的影响及作用机制尚未明确。目的：复制苯丙胺依赖大鼠模型，观察钩藤碱对苯丙胺依赖大鼠条件性位置偏爱效应的影响，检测大鼠脑内伏核及杏仁核NMDA受体2B亚单位的表达及中枢氨基酸类、单胺类及内啡肽类神经递质含量的变化，探讨苯丙胺依赖形成的神经机制及钩藤碱抗苯丙胺依赖的作用机理。设计：完全随

2、机对照实验研究。动物：实验动物采用雄性SD大鼠，经自然位置偏爱时间测定合格动物共96只，体重(200-260)g，由第一军医大学实验动物中心提供。随机分为空白对照组、苯丙胺模型组、阳性药氯胺酮组、钩藤碱系列剂量组及钩藤碱+生理盐水组。方法：钩藤碱对苯丙胺依赖大鼠条件性位置偏爱效应的影响及大鼠脑内伏核和杏仁核NMDA受体2B亚单位表达的实验共分7个组：即(1)空白对照组，(2)苯丙胺模型组，(3)氯胺酮(15mg／kg)+苯丙胺组，(4)钩藤碱低剂量(10mg／kg)+苯丙胺组，(5)钩藤碱中剂量(20mg／kg)+苯丙胺组，(6)钩藤碱高剂量(60mg／kg)

3、+苯丙胺组，(7)钩藤碱(60mg／kg)+生理盐水组，每组8只大鼠。经基线测定合格后随机分组。动物给药方法如下：(2)一(6)组每天上午(8：OO)给予苯丙胺(2mg／kg，so)，连续给药4d；(3)组从第3天起在给苯丙胺之前15min，ip给予氯胺酮(15mg／kg)，连续3d；(4)．(6)组于第二天20：00(B1]给苯丙胺后12h)，分别按上述剂量ip给予中文摘要钩藤碱，连续3d；(1)组以同容量生理盐水替代苯丙胺给药，其他处理同(2)组；∽组每天上午(8：Oo)ip给予钩藤碱(60mg／kg)。各组大鼠下午(16：00)均给予生理盐水(O．5In

4、l，sc)一次，间隔8h。连续4d。各组动物第1天上午注射药物后立即将其置于伴药箱即白箱，下午注射生理盐水后立即将其置于偏爱侧黑箱，搭配时间均为1h，共训练4d。在末次给予苯丙胺24h后进行位置偏爱检测，记录大鼠在白箱中停留的时间。位置偏爱测定结束后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，用4％多聚甲醛灌注固定，取出脑组织，脱水、石蜡包埋。对照大鼠脑解剖图谱，分别选取含伏核、杏仁核部位的切片。严格按照博士德即用型SABC免疫组化染色试剂盒说明书及博士德NMDA-2B原位杂交检测试剂盒说明书操作，免疫组化和原位杂交每组均设阴性对照。封片后显微镜下观察，选取含伏核及杏仁核部位分别

5、照相，并选取相同大小视野下进行阳性细胞计数。脑电超慢涨落分析仪检测大鼠脑内神经递质方法为：复制苯丙胺依赖大鼠模型，共分5个组，其中钩藤碱只设60mg／kg剂量组，给药方法同前。进行位置偏爱测定后采用脑电超慢涨落分析仪，记录大鼠处于安静状态下的脑电信号并进行脑内神经递质信息处理，每只大鼠检测18rain。所有实验数据均采用SPSS(10．o)统计软件进行完全随机设计资料的单因素方差分析和t检验。主要观察指标：苯丙胺依赖大鼠条件性位置偏爱测定实验中记录大鼠15rain内在白箱的停留时间。采用免疫组化和原位杂交技术检测大鼠脑内伏核及杏仁核NR2B阳性细胞形态、分布及

6、其数密度以及NR2BmRNA的表达。使用脑电超慢涨落分析仪观察大鼠全脑分维参数地形图和脑内氨基酸类、单胺类及内啡肽类神经递质含量的变化。结果：连续给予苯丙胺(2mg／kg)4d，大鼠在伴药箱的逗留时间与空白对照组比较明显延长(P

7、显差异，与模型组比较有明显差异f氏0．01)，即不形成条件性位置偏爱。免疫组化和原位杂交检测结果表明，正常大鼠脑内伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA主要分布于胞膜及胞浆，经DAB显色后呈棕黄色。苯丙胺模型组大鼠伏核及杏仁核NR2B、NR2BrnRNA阳性细胞数密度与空白对照组、氯胺酮组、钩藤碱低、中、高三个剂量组及钩藤碱+生理盐水组比较均明显增；bU(P<0．0t)，且胞核亦有着色。氯胺酮组、钩藤碱中、高剂量组及钩藤碱+生理盐水组大鼠脑内伏核及杏仁核NR2B、NR2BmRNA阳性细胞数与空白对照组比较均无显著性差异，钩藤碱低剂量组阳性细胞数量较空白对照组增

8、加(p<0．01)。免疫组化伏核及杏仁