利用sirna抑制狂犬病病毒复制的研究

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1、摘要狂犬病是一种死亡率几乎达到100％的人畜共患急性传染病，至今尚无有效的治疗方法，唯一的措施就是在病毒暴露前后进行免疫预防。但由于存在疫苗质量，保护期，接种时机等问题，致使该病屡有发生，给人们带来生命的威胁。本文拟利用鼢4A干扰技术，抑制狂犬病病毒在细胞和机体中的复制，为今后进行狂犬病的抗病育种研究工作奠定基础。首先根据狂犬病病毒的全长基因信息，利用计算机软件，选择了分别针对狂犬病病毒的N(核蛋白基因)、P(磷蛋白基因)和L(RNA聚合酶基因)基因的4个siRNA靶序列，随后合成了相应的8条寡核苷酸单链

2、，将两两互补的寡核苷酸单链经退火形成siRNA基因，克隆到pStrike-U6载体上，构建了表达siRNA的4种质粒，分别为pU6-siSTRIKEmN(1)、pU6-siSTRIKEmP(2)、pU6-siSTRIKETMLI(3)、pU6·siSTRIKE'rMLa(4)，经PCR检测及测序结果证明，序列正确。在细胞水平上，用脂质体转染的方法，将构建的4个表达载体，分别转染BHK．21细胞，用浓度为1000“g／ml的G--418进行筛选。PCR和RT．PCR实验都证明，表达质粒已经转染进BHK-21

3、细胞，成功获得了稳定表达siRNA的单克隆细胞株。用TcID50=10-．625／25pl的病毒经10倍倍比稀释后对细胞进行接毒，细胞病变结果表明，朱转染质粒的对照细胞与l～4号稳定转染的细胞出现CPE的病毒最大稀释度分别为104、104、l酽、104、10～，可见4种筛选的稳定细胞株较对照细胞，接毒后病毒毒力明显降低；病毒空斑形成试验证明，加入稀释度为104的病毒液后，对照细胞的PFU为lo．7”，o．2ml，l～4号稳定转染细胞的PFU分别为l矿“／0．2ml、Io*”／0．2ml、10。”／0．2m

4、l、10*帅／o．2ml，可见稳定转染的细胞株上病毒滴度都有所降低，1号和4号细胞上病毒滴度降低尤为明显；最后，用筛选的稳定细胞株分别培养病毒，收获病毒液，进行乳鼠脑内接毒，l～4号病毒与正常细胞病毒对乳鼠的LD50分别为：10-3．17／0．02ml、10438，0．02ml、10。”／0．02ml、l旷“／0．02ml和104”／o．02ml。由此可知，I～4号稳定转染细胞株培养的病毒较正常细胞培养的病毒对乳鼠的LD50明显降低，l号和4号的病毒液LD50降低更明显，与病毒空斑形成试验结果相一致。因此

5、，细胞实验结果表明，RNAi对狂犬病病毒的复制有明显的抑制效应。在小鼠个体水平上，通过卵巢注射法，将质粒注射剑性成熟的母鼠卵巢中，然后将其与性成熟的公鼠合笼，怀孕后产下仔鼠，共获得仔鼠85只。PCR检测仔代小鼠的基因组，共获得阳性小鼠32只，阳性率为36．4％。结果表明，siRNA基因已经成功整合入染色体中。但测序结果表明，整合的siRNA基因部分出现碱基突变，其具体原因还在进一步分析中。综上结果，本研究证实了表达siRNA的质粒载体所产生的RNAi效应对狂犬病病毒的复制有明显的抑制作用，为利用RNAi技

6、术来防治狂犬病提供了依据。关键词：狂犬病病毒，RNA干扰，鼠，卵巢直接注射AbstractRabiesisakindofacuteinfectiouszoonosiswhichmortalityisalmost100％。ThereisnOspecifictreatmenttoitasyet．TheonlywayistoimmunizebeforeandpostexposureofRV．Butitstillhappenfrequentlyinmanykindsofanimusandhumanbecauseo

7、fvaccinequality，periodofprotectionandinoculatedtime，andSOon．ThispaperherereportedthatthetechniqueofRNAinterferenceWasusedtorepresstherabiesvirusreplicationincelllineandmouse．Atfirst,accordingtogeneinformationoftherabiesvirusinGenbank,withthehelpofcomputer

8、software。foursiRNAgeneswhichrespectivelyaimalthegenesofN，P，Lweredesignedandsynthesizedartificially．Subsequently，fourdifferentkindsofplasmids，namedaspU6-siSTRIKE’aN(1)、pU6一siSTRIKErUP(2)、pU6-siSTRIKE’”LI(3)、pU6-siSTR