银屑病患者骨髓间充质干细胞转分化为血管内皮细胞的初步分析

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1、山西医科大学硕士学位论文第一章材料与方法1.1标本来源患者组：采集本院皮肤科经临床和病理确诊的进行期斑块型银屑病患者20例，男12例，女8例，年龄14-53岁，平均30.56岁，病程，18d-20年。所有入选病例均除外血液系统及免疫性疾病，取材前2个月内未局部或全身应用过皮质类固醇激素、维甲酸类药物和免疫抑制剂等影响免疫及造血系统的药物，所有取材均征得本人同意；对照组：选择血液科骨髓像正常就诊者15例，经筛选性别、年龄与患者组相匹配，且入选排除条件同患者组，并除外银屑病家族史者，所有取材均征得本人同意。其中2例（均为男性，年龄分别为21岁、41岁）和对照组正常自愿者骨

2、髓1例，男，37岁。进行了高通量差异表达基因。1.2主要试剂人淋巴细胞分离液天津灏阳生物科技有限公司DMEM/F12培养基Hyclon胎牛血清(FBS)Hyclon胰蛋白酶Sigma公司青霉素链霉素混合液华北制药厂CD34-PEBD公司CD45-PEBD公司CD44-FITCBD公司CD29-FITCBD公司HLA-DR-FITCBD公司VWF单克隆抗体Invitrogen血管内皮生长因子(VEGF)Sigma公司碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)Sigma公司1.3主要仪器设备37℃恒温培养箱SANYO公司日本24孔细胞培养板Corning公司96孔细胞培养板Cor

3、ning公司倒置相差显微镜OLYMPUS公司日本1山西医科大学硕士学位论文流式细胞仪(EPICS-XL型)BeckmanCoulter公司超净工作台苏州净化设备有限公司BiofugePrimoR台式低温离心机KendrolaboratoryProductstranswell小室Corning公司超低温冰箱SANYO公司日本1.4实验方法1.4.1BMMSCs的分离及培养从髂前或髂后上棘，采取骨髓10mL，用DMEM/F12培养液1:1稀释后加于淋巴细胞分离液上部，比例是2:1，2000r/min，离心20min，吸取中间的白膜层至新的试管中，以1000r/min离心1

4、0min，弃去上清。重复洗涤细胞2次，然后加入含10%胎牛血清、青霉6素100U/mL、链霉素100μg/mL、DMEM/F12培养基重悬细胞，调整细胞浓度，以1×10/mL密度接种于24孔培养板，置于37°C、5%CO2恒温培养箱中培养。1.4.2BMMSCs体外培养扩增细胞培养48h后，全量换液（弃去未贴壁的细胞），加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12，继续培养贴壁细胞，以后每3d半量换液1次，倒置显微镜下观察生长情况。贴壁的细胞培养48h后即伸展，成梭形或多角形并开始呈克隆性生长，即为骨髓间充质干细胞。生长14d左右近80%融合时，吸净培养液，而后每孔加

5、入新鲜培养基洗脱未贴壁的细胞，然后每孔加入含0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA的消化液200μL消化3min左右，倒置显微镜下观察，待细胞变圆，部分脱落后，加入含血清的培养液终止消化，并轻轻吹打，以1000r/min离心8min，去消化液，加10%胎牛血清的DMEM/F12培养液重悬，接种于24孔培养板培养，为第一代细胞，倒置显微镜下观察生长情况。按上述方法以1:2继续消化传代培养。其中1例银屑病患者细胞培养11d后（男，27岁，病史4年余，父母均患此病）发现BMMSCs有向VEC分化的倾向，而另1例银屑病患者及正常人BMMSCs未见形态改变(对照)，对这1例进行了

6、跟踪研究。1.4.3BMMSCs表面标志鉴定用FITC或PE标记的表面分子CD44、CD29、CD34、CD45、HLA-DR抗体对第三代BMMSCs进行流式细胞术鉴定。1.4.4BMMSCs诱导VEC在细胞传至第三代再培养2d后对银屑病组和正常对照组加入诱导剂（即bFGF102山西医科大学硕士学位论文ng/ml、VEGF50ng/ml、2%胎牛血清的DMEM/F12培养液）诱导VEC分化，每3d半量换液,倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，流式细胞术定期观察细胞分化表达情况。1.4.5流式细胞仪测CD34、CD45、HLA-DR、ICAM-1表达在倒置显微镜下观察，细

7、胞形态出现VEC形态特点时，每个培养孔加入200μL0.02%EDTA消化，用含胎牛血清的培养基终止反应，吸管仔细吹打，离心后去上清，PBS洗5涤1遍，用PBS制成悬液每份1×10个细胞调整到100μl，加入荧光标记的抗体后冰上避光孵育30min，以1000r/min离心8min弃去PBS，再用PBS洗涤1次以去除未结合的荧光抗体，100μLBuffer重新悬浮细胞，在4℃下保存待测，用荧光标记的表面分子CD34、CD45、HLA-DR、ICAM-1抗体对诱导的VEC进行流式细胞术鉴定。1.4.6细胞免疫荧光法测定VEC内VWF、KDR的表达情况当B