斑马鱼angiomotin-like2互作蛋白筛选和功能初步的研究

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3、物有着不可替代的优势，它价格便宜，容易获得，体积小、易密集饲养。斑马鱼的胎间距仅为3个月，雌性斑马鱼每周可产生大量后代，其胚胎的受精及发育都在母体外进行，受精卵大，早期胚胎完全透明，即使在发育的高级阶段，仍然可以观察到全部的细胞。斑马鱼胚胎发育非常迅速，从受精到孵出大约3d，主要器官都在受精后24h内形成，在胚胎发育时期，其体型不会发生多大变化；而且，来自于同一母体的胚胎是同步发育的，易于大量收集特定阶段的同期胚胎材料。目前一种新的手段——注射反义吗啉环寡聚核苷酸以抑制某一特定基因的表达的方法已经在斑马鱼上得到了

4、很好的应用。此外，斑马鱼基因组的测序工作也已经完成。因此，本实验室也以斑马鱼作为模式生物，对其胚胎发育过程中重要的蛋白因子kngiomotinLike2进行分子生物学方面的研究工作。Angiomotin是通过以Angiostatin为诱饵的酵母双杂交系统筛选得到的，它是Motin家族的成员之一，该家族迄今为止还发现有另外两个成员，它们是AngiomotinLike1(AmotLI)和AngiomotiFILike2(AmotL2)。它们在分子结构上都有保守的coiled—coildomain和C-terminal

5、PDZbindingdomain。kngiomotin可以介导kngiostatin对体外内皮细胞迁移和微管形成的抑制作用，促进血管生成，这种介导作用依赖于其分子结构中的PDZbindingdomain。Angiostatin是一种血管生成作用的抑制分子，它可以抑制上皮细胞的迁移，增殖以及微管的形成：这种抑制作用依赖于Angiomotin的结合，研究表明Angiomotin在血管生成过程中起核心作用。本实验室从5体节时期斑马鱼胚胎的eDNA文库中应用基因芯片技术筛选得到了对FGF信号通路响应的新基因angiomo

6、tin—like2(amotl2)，它在斑马鱼中从未有过相关报道，amotl2基因编码区全长为2166bp，形成的蛋白长721个氨基酸残基。从序列信息中我们得知它与小鼠的kngiostatin结合蛋白Angiomotin有很高的同源性，通过整胚原位杂交实验，已经检测到斑马鱼‘t-‘山东师范大学硕士学位论文zAmotL2的表达谱，还发现zAmotL2的表达可能与胚胎内的细胞迁移事件有关并受到FGF信号通路的调控。由于zAmotL2在基因序列和结构上与~Iotin家族的成员有很高的同源性，其可能的与细胞迁移有关的生物

7、学功能以及响应胚胎FGF信号通路的功能都对斑马鱼胚胎细胞迁移和血管生成的分子机制的研究带来了新的探索，甚至有望通过解开肿瘤血管生成抑制因子angiostatin的作用机制达到利用生物科技治疗肿瘤的目的，因此我们将其作为研究对象，通过检测蛋白质相互作用的实验方法寻找与之互作的蛋白。我们以斑马鱼不同时期胚胎(1细胞期、40％#b包、24小时)的mRNA混合物为模板构建了cDNA文库，通过酵母双杂交技术筛选到了约30种能够与zAmotL2发生相互作用的文库蛋白，在筛选得到的阳性克隆中挑选出了Dapperhomolog2

8、(Dpr2)蛋白和Glycogensynthasekinase3(Gsk3)蛋白作为下一步的研究对象。这是因为这两种蛋白在脊椎动物胚胎发育的重要信号通路如Nodal信号和Wnt信号中都起着十分重要的作用，且目前研究现状也比较成熟，对于进一步揭示zAmotl2对胚胎发育的细胞迁移、血管发生等生命活动具有重要的研究意义。关键词：斑马鱼、zAmotL2、酵母双杂交、Dpr2、G