SNT1681-2011-蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１６８１—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犃犿犲狉犻犮犪狀犳狅狌犾犫狉狅狅犱狅犳犺狅狀犲狔犫犲犲狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１６８１—２０１１前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替了ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５《蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法》。本标准与

2、ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５相比，主要技术变化如下：———修改了标准的名称；———增加了“现场检验检疫”、“生理特征鉴定”及“ＰＣＲ检测”内容；———修改了原标准的“采样方法”、“直接检查法”及“分离培养与鉴定”。本标准修改采用国际兽疫局（ＯＩＥ）《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）中２．２．２章，主要修改如下：———原文中“ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”等内容经修改简缩后作为本标准附录Ａ；———原文格式及内容顺序排版上做了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北

3、出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、曾宪东、冯汉利、陈建军、赵晖、颜志立、朱堂明、王振华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１６８１—２０１１蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范１范围本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的现场检验检疫、采样、实验室诊断等检疫技术规范。本标准适用于进出境蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检疫及本病的流行病学调查、诊断和监测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期

4、的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８出入境动物检疫采样３试剂和材料３．１幼虫芽孢杆菌（犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊犾犪狉狏犪犲ｓｕｂｓｐ．犾犪狉狏犪犲）标准菌株由ＯＩＥ参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。３．２引物３．２．１ＰＣＲ引物上游引物：５’ＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＣＧＧＧＡＧＡＣＧＣＣ３’下游引物：５’ＴＣＴＴＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＧ３’扩增片段大小：１１０６ｂｐ。３．２．２巢式ＰＣＲ

5、引物３．２．２．１巢式ＰＣＲ外侧引物上游引物：５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＴＧＴＴ３’下游引物：５’ＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＧ３’扩增片段大小：９６９ｂｐ。３．２．２．２巢式ＰＣＲ内侧引物上游引物：５’ＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＧ３’下游引物：５’ＴＣＡＧＴＴＡＴＡＧＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣ３’扩增片段大小：５７２ｂｐ。３．３犜犪狇酶。３．４ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。３．５ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。３．６溴化乙锭。３．７异丙醇。３．８１０ｍｍ

6、ｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）。３．９胡萝卜酵母琼脂培养基。３．１０马铃薯培养基。３．１１酵母浸膏培养基。１标准分享网www.bzfxw.com免费下载版权所有·禁止翻制、电子发售犛犖／犜１６８１—２０１１４器材和设备４．１ＰＣＲ扩增仪。４．２电泳仪及电泳槽。４．３凝胶成像分析仪。４．４恒温培养箱。４．５高速冷冻离心机。４．６普通光学显微镜。５现场检验检疫临床变化特征结合病原鉴定是诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病的依据（参见附录Ａ）。开箱，提蜂脾查看，出现下列病理变化特征之一者，可做出初步诊断

7、。颜色变化：房盖潮湿、下陷、颜色发暗显油光。通常，患病幼虫身体变软，虫体在患病１周内体色为白色至棕黄色，２周后为深棕色，３周后为棕黑色。死亡幼虫的头部朝向房盖，虫体顺着背部下塌，虫体由正常呈“Ｃ”型变为呈竖立姿势。患病幼虫残体１个月后干涸，形成硬黑色的鳞片，紧贴巢房下侧，在３１０ｎｍ～４００ｎｍ紫外光照射下可发出荧光。巢房变化：出现“插花子脾”现象，即后期房盖穿孔，巢脾上出现空巢房与卵房、幼虫房、封盖房相间排列的现象。丝状、粘性物：用一根火柴杆插入虫体可拉出长１０ｃｍ～１５ｃｍ、褐色、胶体状、有鱼腥臭味的细丝。蛹舌现象

8、：蛹期发生死亡的蛹在蛹房顶部有蛹头突出的现象是美洲幼虫腐臭病典型的症状之一。６采样按ＧＢ／Ｔ１８０８８要求，采集蜂巢的病变区域或疑似受感染的蜜蜂幼虫作为首选样品，亦可用蜂房（不小于２０ｃｍ２）或取临近蜂巢的蜜蜂食物（３０ｇ～５０ｇ）作为样品。７实验室诊断７．１病原形态学鉴定取幼虫５条～１０条，置研钵中，加少量无菌水，制成悬液，取悬