东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究

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1、华中农业大学博士学位论文东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究姓名：周丹娜申请学位级别：博士专业：预防兽医学指导教师：赵俊龙20090501东方巴贝斯虫免疫相关蛋白的基因克隆及功能研究摘要东方巴贝斯虫(Babesiaorientalis)是一种由镰形扇头蜱传播的重要血液原虫，主要引起水牛巴贝斯虫病。该病在我国长江以南许多省份发生和流行，临床上患病牛以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿等为特征，甚至引起死亡，造成重大的经济损失。本实验室已完成了对B．orientalis的形态学、生活史、传播媒介和分子分类学研究，从多种研究角度

2、证实了该虫为一新种，并构建了B．orientaliseDNA文库。本研究以该文库为基础，用制备的B．orientalis单抗和多抗对B．oriental&eDNA文库进行免疫筛选。对筛选得到阳性克隆子进行DNA序列的测定、拼接和分析，并进一步克隆表达单抗所筛得的东方巴贝斯虫蛋白BOP29，对BOP29蛋白进行了west-blotting检测和原位间接免疫荧光定位。利用表达的重组BOP29蛋白构建间接ELISA诊断方法，并初步应用于血清流行病学的调查。(1)B．orientalis单克隆抗体的制备从感染B．orientalis

3、的染虫血中提取东方巴贝斯虫虫体全蛋白。用粗提的东方巴贝斯虫裂殖子全抗原免疫Balb／c小鼠，制备免疫脾细胞，通过常规的细胞融合技术与sp2／0骨髓瘤细胞融合，用东方巴贝斯虫裂殖子抗原(BoMAg)、东方巴贝斯虫体外培养上清(BoECSAg)作为捕获抗原来筛选阳性克隆，最后得到了11株高效价的单克隆杂交瘤细胞系，分别为ⅣC2A71Glo、IVc2A72E2、IVC2ATlF6、IVC2A72G4、IVC2A72C5、IVC2A72FIo、IVC2A71E3、[VC2A72F2、VC9C6A2、VC9C781和VC9C6C11。

4、为eDNA文库的免疫筛选奠定基础。(2)t7．orienta凰eDNA文库的筛选用自制的东方巴贝斯虫单抗和多抗对该虫的eDNA文库进行筛选。得到与单抗VC9C6Cll对应的东方巴贝斯虫BoP。29蛋白的基因序列和与多抗发生免疫反应的8个东方巴贝斯虫蛋白的基因序列：ms．7．1，ms．37．1，ms．59．1，ms．70．2，ms．88．2，ms．99．1，ms．110．1和ms．128．1。经过测序比对和蛋白预测，显示单抗筛得的BOP29蛋白约为29kDa，DNAstar预测该蛋白的等电点为9．68，有很好的抗原性；多抗筛得

5、8个蛋白中ms．7．1、ms．37一l、ms．59．1、ms．99．1和mS．110．1与牛巴贝斯虫的某些已公布的蛋白有较高的同原性，ms．88．2克隆子与布氏锥虫假定蛋白Tbl0．70．1650有34％的同原性，ms．70．2和mS．128．1在同源比对中没有任何相关信息，可能是东方巴贝斯虫特有的新蛋白，其结构功能还待进一步研究。华中农业大学博士学位论文(3)BoP．29蛋白的克隆表达根据EST测序的结果，设计一对特异性扩增B．orientalisBOP29基因开放性读码框(0I强)的引物，克隆了B．orientalisB

6、OP29的ORF全长基因，构建原核表达质粒pGEX—KG—BOP29和pET-28(a)．BOP29，在E．coliBL21．CodonPlus中实现了高效表达。(4)BoP一29蛋白的定位与免疫原性的初步研究将重组BOP29的表达产物经Western．blot检测分析，结果表明原核表达的BOP29具有较强的免疫反应原性。将染虫率为1％的新鲜牛血制成血推片，固定后，用单抗VC9C6C1l做为一抗，羊抗鼠IgG．FICT抗体做为二抗来完成间接免疫荧光实验，并再用吖啶橙染核。将制好的血液推片置于荧光显微镜下观察，可见染虫红细胞中

7、的虫体核部发橙色荧光和与单抗结合发出绿色荧光的虫体膜表面。再次证实BoP．29确实来源于东方巴贝斯虫。(5)His-BoP一29间接ELISA诊断方法的构建和应用将重组的His-BoP29蛋白按倍比稀释的方法包被ELISA板，测定其最佳包被浓度。用参考阳性血清和参考阴性血清确定His-BoP-29间接ELISA的临界值为O．25，有良好的敏感性和特异性。用该间接ELISA方法完成了对感染牛血清中抗体水平的监测，并检测了来自武汉、湖北大冶、湖北嘉渔和湖北鞍山临床血清样本共132份，共检出阳性39份，总检出率为29．5％，而用本

8、实验室已构建好的东方巴贝斯虫巢式PCR检测结果(33．3％)无显著差异。本研究以B．oriental&的eDNA文库为基础，利用制备的东方巴贝斯虫的单抗和多抗血清筛选文库，获得9个巴贝斯虫相关蛋白的基因序列，为水牛巴贝斯虫病的免疫预防、致病机制等研究奠定良好的基础。对单抗筛得的BOP29蛋