嗜水气单胞菌asd―1基因功能研究

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1、嗜水气单胞菌asd―1基因功能研究　　摘要：asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶，该酶可影响革兰氏阴性菌的细胞壁正常合成。为了研究嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）asd-1基因的功能，采用OverlapPCR方法敲除该基因，结果显示asd-1基因的敲除明显降低了嗜水气单胞菌的生长速度，但是不会导致突变株对二氨基庚二酸（DAP）的强制需求，进一步对氨基酸序列分析表明asd-1蛋白质较迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌的asdA蛋白质多出3个氨基酸，其中Asn-257导致asdA蛋白质中的关键活性位点Arg-267在asd-1蛋白质中改

2、变为Val-267，该研究表明嗜水气单胞菌的asd-1基因突变显著降低其生长速度。　　关键词：嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）；asd-1基因；生长速度；二氨基庚二酸（DAP）　　中图分类号：S941文献标识码：A文章编号：0439-8114（2016）10-2667-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.10.054　　Abstract：Aspartateβ-semialdehydedeshydrogenasewhichparticipatedinthecellwallsynt

3、hesiswasedcodedbyasd-1gene.InordertorevealingthefunctionofAeromonashydrophilaasd-1gene，thisstudydeleteditbyoverlapPCRtechnology.Theresultshowedthatthebacteriagrowthratedecreasedsignificantlywhen8asd-1genedeleted，buttheobligaterequirementfordiaminopimelicacid（DAP）inasd-1mutants

4、wasnotchanged.Aminoacidsequencsalignmentfurthershowedthatasd-1proteinhad370aminoacids，buttheasdAproteinofEdwardsiellatadaandEdwardsiellaictalarijusthad367aminoacids.TheAsn-257resultedthekeysiteArg-267inasdAproteinchangedtoVal-267inasd-1protein.Itindicatedthatasd-1genemutantdec

5、reasedthegrowthrateofAeromonashydrophilasignificantly.　　Keywords：Aeromonashydrophila；asd-1gene；growthrate；diaminopimelicacid（DAP）　　嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是一种在水样环境中广泛存在的细菌，该菌极易接触动物，如鱼、青蛙和人类等，到目前为止已经从鱼、食物、环境及临床样品中分离出该菌并且认为该菌是鱼、爬虫动物及人类的一种重要的病原菌，该病原常引起疖疮病、溃疡性结肠炎和细菌性败血症等疾病，具有发病

6、鱼种类多，流行范围广，多呈急性流行，发病后死亡率高的特点，在渔业养殖中由嗜水气单胞菌引起的鱼类死亡每年给全球带来巨大的经济损失，同时嗜水气单胞菌也是许多鱼类疾病的共感菌[1-4]。　　asd-1基因编码天冬氨酸半醛脱氢酶（Asd；EC1.2.1.11），该酶是一种高度保守的同源二聚体酶，可将β-天冬氨酰磷酸转换为β8-半醛天冬氨酸盐。同时天冬氨酸半醛脱氢酶也是赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸等关键氨基酸生物合成的必需蛋白，同时它还在合成二氨基庚二酸（DAP）的反应中起关键作用，而DAP是革兰氏阴性菌及部分革兰氏阳性菌细胞壁成分肽聚糖的必需物质[5-

7、7]。天冬氨酸半醛脱氢酶功能的缺失将导致细菌对DAP的强制性需求，否则细菌将裂解，在迟缓爱德华氏菌、鲶爱德华氏菌、嗜肺军团菌中已经得到证实[8-10]，但在嗜水气单胞菌的研究中尚未见相关报道。为了揭示asd-1基因在嗜水气单胞菌中的功能，本研究通过OverlapPCR技术敲除asd-1基因以探讨该基因的功能。　　1材料与方法　　1.1试验材料　　试验所用嗜水气单胞菌AH-1菌株来自中国科学院水生生物研究所聂品实验室，其他所用菌株及质粒为武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所鱼病室保存，详见表1。　　试验所用酶制剂来自TaKaRa公司，基因组提取试剂

8、盒、质粒提取试剂盒及胶回收试剂盒购于天根生化科技有限公司，试验所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。　　PCR产物纯化