基因工程药物设计

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1、引钩TTTTAAAAAAAATTTTVmRNACmKNAIcDNANaOHAttcDNA基因工程药物设计目的基因的获得反转录法1、mRNA的纯化：真核细胞mRNA3,端有一多聚腺廿酸-polyA,用亲和层析法mRNA从细胞中分离出来2、cDNA的笫一链合成：mRNA3、cDNA第二链合成：用碱解或RNaseH酶解法除去cDNA-mRNA中的mRNA,再以cDNA为摸板合成第二链，再用核酸酶SI酶切除单链DNAo4、cDNA克隆：克隆载休有：质粒DNA、噬菌体DNA载体转导或转化宿主细胞5、cDNA文库鉴定:根据表型进行筛选如抗性棊因失活法

2、、菌落颜色变化等6、冃的cDNA克隆的分离和鉴定：分离方法：核酸探针杂交法：根据目的基因蛋口质纯品aa序列分析，人工合成单链寡核昔酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克降。反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）mRNA经反转录合成cDNA第一链，不盂再合成cDNA第二链，而是在特殊引物协助下，利用PCR扩增，特异地合成目的cDNA链，用于克降重组化学合成法较小分子蛋口质或多肽的编码基因在己知其核甘酸序列的条件下，化学合成此基因DNA不同部位的两条链的寡核昔酸矩序列，再退火成两端形成黏性末端的DNA双链片段基因筛选编码序列富集法利用磁

3、场力对CDNA文库屮的目的基因进行富集；将质粒DNA库酶切后连上接头，用5,端以生物素标记的与街头序列和同的引物序列进行PCR扩增。将cDNA文库的插入片段同样扩增后，两者杂交得到带有生物素的DNA双链，溶液加入含磁珠核心的链爲抗生素蛋白，加外磁场，目的基因与其他DNA片段分离被富集岛屿获救PCR法直接从已测序的基因组DNA上寻找编码序列，计算机分析找出开放阅读框，外显子陷阱法或寻找CpG岛克隆编码基因CpG岛(CpGislands)含有大量胞脚症C、鸟嚓吟G的DNA片段,在基因组DNA中均匀地分布着Alu序列(Alu重复序列属于SINE

4、家族，序列中冇限制性内切核酸酶Alu的识别序列AGCT)利用这两段序列，给CpG岛特有的限制晦切割后片段加上泡状接头，再用泡状引物和Alu特异性引物进行PCR扩增，电泳分离出特异片段作为探针对cDNA文库筛选功能克隆法利用棊因敲除RNA干扰酵母双杂交高通虽筛选流式细胞术等从基因蛋白质表达调控等多水平获得基因功能信息构建cDNA文库EST提供引物信息，PCR扩增特异片段差异显示技术的应用mRNA差界显示减数PCR差减杂交等技术寻找新基因*对已发现基因的改造基因修饰及点突变研究基因新功能基因表达构建表达载体获得目的基因后，选择合适的宿主进行表

5、达，基因表达的微生物宿主有两类：原核细胞，以人肠杆菌，枯草杆菌，链霉菌等为主；真核细胞，冇酵母和真菌等。①人肠杆菌休系屮的展因表达Pbv220系统组成：来源于PUC8多克隆位点核糖体rrnB基因终止信号PBR322笫4225〜3735位pUC18第2066〜680位X噬菌体clts857抑制了慕因及PR启动了PRC23的PL启动子及SD序列pBG-2系统pBG-2是由pBV220系统衍牛的便丁产物纯化的融合表达载体在PRPL启动了下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具冇与Ig

6、G结合的活性，可用亲和层析简化卜•游工艺pET系统插入基因的转录和翻译系统來源于T7噬菌体。表达由位于宿主细胞染色体上的T7-RNA上宿主细胞染色体上的T7-RNA聚介酶控制,大肠杆菌衰达戦体pET-5aT7-RNA聚合晦丿动子为lacUV5,由IPTG诱导②酵母休系屮的基因表达Yep类（yeastepisomalplasmid酵母附加体质粒）YRp类（yeastreplicationplasmid酵母复制型质粒）YCp类（yeastcentromericplasmid酵母着丝粒质粒）Yip类（yeastintegrativeplasmi

7、d酵母整合型质粒）克隆载体：向酵母载体中引入大肠杆菌质粒pBR322的ori部分和Ampr或Tetr部分,构成的载体同时带冇细菌和酵母的复制原点和选择标记。表达载体：可引入外源基因在酵母细胞内保存复制并随酵母分裂传递到子代DNA中体外重组DNA连接酶：人肠杆菌DNA连接酶：二磷酸I此咙核卄酸为辅助因子T4噬菌体DNA连接酶：ATP为辅助因子（多用）T4噬菌体DNA连接酶作用机制黏性末端链接AArrcECoRI切割的目的基因GCTTAA5・AAIIC「GI_CTTAA)G「一》CITAA&AATTC*彳G连接酶GCTTAAAA1re连接酶E

8、CoRIDNA虫组体EcoR12、钝端连接1）加同聚尾连接AAAA末端脱氧核昔酸转移酶AAAA■dATPTTTTDNA连接酶2）加人工接头连接GAATTCCTTAAGT4连接酶GAATTCCT