分子生物学实验方法与步骤(2)

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1、DNA分子的限制性内切酶消化限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至

2、对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2.20μl体积反应体系如下：DNA0.2-1μg10×酶切buffer2.0μl限制性内切酶1-2u（单位）加ddH2O至20μl   限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化

3、1hr。3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。5.酶切结束时，加入0.5MEDTA（pH8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3MNaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g×5min。倾去含大部分蛋白

4、质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH7.6）。7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。二、电泳检测取质粒酶切产物适量，加适当loadingbuffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。三、注意事项1.浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。2.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶

5、以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。5.注意星号酶切活力。DNA片段回收与纯化质粒、噬菌体等经酶切，电泳；PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。DNA回

6、收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。一、冻融法1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；2.加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH7.6），振荡混匀；3.-20℃放置5-10min；4.4℃离心10000g×5min，上层液转移置另一离心管中；5.加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；6.-20℃，放置5-10min；7.4℃离心10000g×5min，合并上清液；8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；9.加入1/10体积3

7、MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；10.-20℃，静置30min；11.4℃离心13000g×10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；12.加适量H2O或TE溶解沉淀。二、DNA回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）1.  紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。2.  加入BufferQG（每100mg凝胶加BufferQG300μl），置50℃水浴10min。3.  若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝

8、胶加异丙醇100μl），混匀。4.  将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。5.  4℃离心13000g×1min，弃去收集管中液体。6.  加入500μlBufferQ