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1、小鼠树突状细胞的体外培养与鉴定作者：田蓉，李巍，于继云，刘玉峰【关键词】树突细胞 Invitrocultureandcharacterizationofmousespleendendriticcells 【Abstract】AIM:Toexploreandoptimizethemethodsforinvitrocultureofmousedendriticcells(DC)thatorphologicallyandidentifiedbiologically.METHODS:Miceg/kgcyclophosphamidethroughthet
2、ailvEin,andethodsfirstly,and3dlaterconditionalmediumcontainingIL4,GMCSFicroscope,scanningelectronmicroscope,andtransmissionelectronmicroscopeanalysis.Atday3,5,7,cellsarkers.RESULTS:CulturedcellsdisplayedatypicalDCphenotypeinmorphologicalanalysis,andFACSshoarkersasCD11c,CD86,ⅠA
3、b,H2D6.CONCLUSION:UsingofIL4,GMCSF,TNFαasstimulatorsinthemousespleencellculturecanobtainDCakesafoundationforfutureresearchonthebasicandclinicalusageofDC. 【Keyolecule 【摘要】目的：探索、优化体外诱导和扩增小鼠树突状细胞（DC）的方法，并进行形态学观察和生物学鉴定.方法：应用环磷酰胺200mg/kg经尾静脉注射Balb/c小鼠，8d后处死小鼠，常规培养脾细胞，第3日加入含有IL4,G
4、MCSF细胞因子的条件培养液，第5日补加TNFα,第8日制备标本进行相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，并分别在培养第3,5,7日经流式细胞仪检测成熟细胞表面标志.结果：刺激培养细胞经相差显微镜、扫描电镜、透射电镜观察，具有典型的DC形态，流式细胞仪检测发现细胞表面表达CD11c,CD86,ⅠAb,H2D6标志物.结论：在小鼠脾脏细胞培养中加入IL4,GMCSF,TNFα等刺激，可获得足量、较高纯度的DC，为DC的基础研究与临床应用奠定了基础. 【关键词】树突细胞；细胞因子；MHCⅡ类分子 0引言 自从StEInman等于1973年发现树突状
5、细胞（dentriticcell,DC）以来［1］，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞，其强大的提呈抗原作用和启动初始T细胞的能力，日益引起国内外学者的关注.特别是DC与肿瘤免疫的密切关系以及在抗肿瘤方面的独特功能，使其成为肿瘤免疫研究的一个重要领域.DC来源于骨髓CD34+细胞［2］，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键，然而DC在体内分布散在，含量极低，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%.目前体外培养DC的方法尚不尽人意，在很大程度上限制了对DC基础和临床工作的开展.我们在体外培养扩增了Balb/c小鼠的DC细胞，在培养中添加
6、IL4,GMCSF,TNF等刺激，并通过相差显微镜、电镜观察和流式细胞仪检测分析对所培养细胞进行鉴定，为优化DC的体外培养方法进行积极的探索. 1材料和方法 1.1材料环磷酰胺购自上海华联公司；荧光标记抗体：CD11cFITC,IAbFITC,H2DbFITC,CD86FITC购自Diaclone公司；rmGMCSF,rmIL4,TNFγ，胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶购自美国GIBCOL公司；Hepes，青霉素，链霉素购自美国Sigma公司；倒置相差显微镜为日本Olympus公司生产，低速离心机为北京医用离心机厂生产，微量台式高速离心机为
7、德国Heraeus公司生产，流式细胞仪为Coulter公司生产，扫描电镜、透射电镜由美国BD公司生产；6~8g/kg体质量由小鼠尾静脉注射，8d后颈椎脱位处死小鼠，750mL/L乙醇浸泡10min，无菌条件下用镊子取出脾脏移入放在平皿的100钼钢网上，剔除脾周围的结缔组织，剪碎、研磨后收集滤过的细胞悬液，离心800r/min,7min，加TrisNH4Cl3mL，溶除红细胞，获取细胞悬液，以完全培养基悬浮为1×109/L细胞，37℃，50mL/LCO2孵箱培养.3d后，吸弃全部培养基及悬浮细胞，加rmGMCSF/rmIL4条件培养基隔日半量换液，第
8、5d补加细胞因子TNFγ1mg/L，第7d吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，次日收集悬浮的细胞即为富集的DC.相差显微镜下
