钙离子对体外培养皮肤角质形成细胞增殖与分化的调控作用论文

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1、钙离子对体外培养皮肤角质形成细胞增殖与分化的调控作用论文.freel2细胞密度接种于含不同浓度CaCl2角质形成细胞培养液的96孔板中，培养1周，每日观察细胞生长情况，至第7日以MTT法检测OD值。结果当CaCl2浓度低于5mg/L时，细胞贴壁增殖缓慢，甚至无法贴壁；浓度为12.5mg/L时Kc呈单层快速生长，并能保持较好的表型，是体外Kc培养扩增的最适钙离子浓度；当CaCl2的浓度达到25mg/L时，Kc形成复层，集落中央出现大量分化程度较高的角化细胞和角化物，周边仍存在增殖能力较强的单层Kc，逐渐向四周扩展。随着Ca2＋浓度的增高，细胞角化程度也随之

2、增高。结论Ca2+浓度对体外培养的Kc贴壁、增殖、分化等不同阶段产生影响，通过控制无血清培养液中Ca2+浓度可以调控Kc的增殖和分化。【关键词】钙离子角质形成细胞分化人工皮肤组织工程Calciumisoneofthekeyfactorsadjustingproliferationanddifferentiationofepidermalkeratinocytesculturedinvitro【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsofcalciumatdifferentlevelsonproliferationandd

3、ifferentiationofepidermalkeratinocytesculturedinserumfreemediuminvitro'alkeratinocytesofneonatalrabbits2'andculturedfreemediumcontaineddifferentlevelsofCaCl2for1munohistochemicaltest.Then'MTTtest.ResultsTheresultsshog/LCaCl2.AstheconcentrationofCaCl2g/L'keratinocytesgroono-layerk

4、eepingitsg/L'keratinocytesbecamestratumanddifferentiatedapparently.ConclusionItissuggestedthatcalciumisoneofimportantfactorstodecidethegroalkeratinocytes.Tcouldbeusedtoculturekeratinocytesandartificialepidermisoftissueengineeringinvitrorespectively.【Keykeratinocyteserumfreecultur

5、eartificialskintissueengineering1材料与方法1.1试剂K-SFM(GIBCO，不含钙，其完全培养液按说明书添加CaCl2)，大豆胰酶抑制剂(SIGMA)，CaCl2(分析纯，国产)，硫酸链霉素（SIGMA），角蛋白免疫组化试剂盒（武汉博士德公司），MTT（SIGMA），DMSO（AMRESCO），胰蛋白酶(HYCLONE)，中性蛋白酶（SIGMA）。1.2设备器材超净工作台(国产)，二氧化碳培养箱(SANYO)，倒置生物显微镜(OLYMPUS)，酶联免疫检测仪（国产），塑料培养板（皿）（Nunc）。1.3实验动物日本大耳白

6、兔，来自长春208医院动物部。1.4实验方法1.4.1Kc的分离培养取新生兔背部皮肤，Kc的分离、培养和传代方法及角蛋白(广谱)ABC免疫组化鉴定按文献［1］进行。1.4.2Ca2+浓度对Kc增殖分化的影响(1)取第二代Kc，D-Hank’s离心洗3次后，以不含Ca2+的K-SFM制成细胞悬液，按0.5×104细胞数/孔接种于96孔板，同时添加20μl不同浓度CaCl2，CaCl2终浓度分别为0、2.5、5、12.5、25、50、100、200、400mg/L，均在36℃5%CO2条件下培养1周，每日观察细胞生长情况，1周时以MTT法检测OD值。(2)取

7、第二代Kc'按1×104细胞数/孔接种于6孔板内盖玻片上，以含12.5mg/LCaCl2的K-SFM培养1周后，实验组更换为25.0mg/LCaCl2的K-SFM继续培养，待Kc形成复层后再换成无钙K-SFM进行培养，观察Kc的生长情况及形态变化并做角蛋白(广谱)ABC免疫组化染色分析。2结果与讨论无血清培养液中Ca2＋的浓度对Kc的生长分化极为重要。培养液中Ca2+浓度可影响Kc的增殖分化，其浓度不同，Kc生长状态也不同［2］。在低Ca2+浓度（0.1mM）条件下，培养的Kc可不形成细胞间连接而迅速扩增，而通过增加胞外Ca2+浓度（1.2～2.0mM）

8、，可诱导发生多种变化，包括形成复层、桥粒和黏着连接［3，4］。钙是细胞分化过程的