针刺对肥胖模型大鼠中胰岛素和胰岛素底物表达的影响

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1、针刺对肥胖模型大鼠中胰岛素和胰岛素底物表达的影响作者：龚美蓉，徐斌，毛珍，邵清华，孙永【摘要】　　目的观察针刺对肥胖大鼠血清胰岛素含量和胰岛组织胰岛素受体底物1，2（IRS-1，IRS-2）表达的影响，探讨针刺对高脂饮食性肥胖大鼠胰岛素抵抗的影响。方法采用实时定量PCR技术测定胰岛素受体底物1，2（IRS-1，IRS-2）基因表达水平,酶联免疫测定法测定血清中胰岛素的含量，生化比色法测定血清葡萄糖含量。结果针刺治疗取得良好减肥疗效的同时，肥胖大鼠血清中葡萄糖及胰岛素水平明显回降，而胰岛组织胰岛素受体底物1（IRS-1

2、）基因表达水平却明显升高。结论针刺可改善肥胖大鼠胰岛素信号转导，减轻胰岛素抵抗。【关键词】胰岛素抵抗；肥胖；大鼠；胰岛素受体底物肥胖已成为现代生活的流行病，其发病过程复杂,危害严重［1,2］，对肥胖的研究已成为21世纪科学研究的迫切任务。有研究表明肥胖大鼠血中胰岛素（INS）含量异常升高,肥胖机体具有高胰岛素血症，这些结果证明了肥胖机体存在着胰岛素抵抗（IR）［3～5］。本研究应用酶联免疫测定法和实时定量PCR技术观察针刺治疗前后肥胖大鼠血中胰岛素的含量以及胰岛IRS-1和IRS-2基因表达的水平，以探讨针刺对单纯性

3、肥胖致胰岛素抵抗的影响及其可能的作用机制。　　1材料　　设计：随机对照动物实验。　　时间及地点：实验于2006-10～2007-01在南京中医药大学动物实验中心、江苏省针灸学重点实验室（BSL-3）完成。　　材料：刚断乳的健康清洁级雄性SD大鼠90只，体质量50～70g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供（动物许可证号：SCXK（沪）2003-0002）。仪器和试剂：韩氏LH402A穴位神经电刺激仪，UV-754分光光度计（上海第三分析仪器厂），DG5031酶联免疫检测仪（华东电子管厂），基因扩增仪MJ-mini

4、（BIO-RAD公司），实时定量PCR仪Mx3000P(Stratagene公司)，血清葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司），血清胰岛素Elisa试剂盒（批号：ADL原装96TElisa），总RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen公司），反转录试剂盒M-MLV（Promega公司），SYBRGreenⅠ(Stratagene公司)。　　2方法　　2.1单纯性肥胖大鼠模型的制作选用刚断乳的健康清洁级SD雄性大鼠90只,体质量50～70g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。参照刘氏提供的实验性肥胖造模

5、方法［6］改进，大鼠适应饲养1周后，随机挑选10只，用普通饲料喂养，称正常组。另一组80只，用由苏州双狮实验动物饲料有限公司提供的高脂致肥饲料喂养，称高脂组，分组时两组大鼠体重无差异。以体重超过普通饲料组10%为肥胖标准，4个月后，造模成功30只。　　2.2动物分组造模后，将获得的肥胖大鼠30只随机分为肥胖模型组和针刺组，每组各15只。　　2.3治疗方法针刺组：将大鼠捆绑于自制的固定器中，用环球牌32号无菌针灸针针刺一侧“足三里”穴和“内庭”穴，左右侧隔日交替轮换取穴。施平补平泻手法后，“足三里”穴、“中脘”穴连接韩

6、氏LH402A穴位神经电刺激仪，频率2/15Hz，强度2mA，治疗时间15min/d，每6d休息1d，共观察39d，治疗或束缚33次。治疗或束缚期间所有大鼠均普通饲料自由饮食。模型组：将大鼠捆绑于自制的固定器中，捆绑时间同针刺组，余不作处理。　　2.4标本提取各组大鼠实验期间均采用普通全价鼠饲料喂养,自由摄食和饮水,每日更换饲料和水。实验前后观察大鼠摄食量、饮水量、体质量、体长及Leeps指数等。实验结束后,禁食过夜,次日眼球采血，2000r/min离心20min，分离血清，-20℃保存待测。断头处死,迅速分离出胰岛

7、置于液氮中保存。　　2.5生化比色法测定血清葡萄糖试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司），所有测定步骤和计算公式均严格按照试剂盒说明书操作。胰岛素敏感指数（IAI）=1/（空腹胰岛素×空腹葡萄糖）　　2.6ELISA法测定胰岛素血清胰岛素（INS）检测药盒由上海天呈生物信息科技有限公司代理进口（批号：ADL原装96TElisa）。用酶联免疫法，测定相应光密度，根据标准曲线计算出胰岛素的浓度，数据以ng·ml-1来表示。所有测定步骤和计算公式均严格按照试剂盒说明书操作。　　2.7SYBRGreen实时定量PCR检测　　2.

8、7.1总RNA制备胰岛组织100～200mg，分别加入1mlTrizol,按试剂说明书中操作步骤进行RNA提取。使用Eppendorf公司的核酸蛋白测定仪检测抽提总RNA的质量和浓度。要求A260/A280比值约2.0，并计算RNA含量。　　2.7.2cDNA合成反应体系20μl。取5×反应缓冲液4μl，dNTP（10mmol/L）2μl，Ol