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1、中药研究与开发论文.freelonStaphylococcusaureus.MethodTotalanthraquinoneseasuredbybisectionmethod.ResultEmodin,aloe-emodin,rheinhastheeffectofrestrainingbacterium,chyrsophanolandphyscionhasnottheeffectofrestrainingbacterium.Oftheeffectonrestrainingbacterium,emodinisthebest,thenisaloe-
2、emodin,rheinisthehastheeffectofrestrainingbacterium.Key；staphylococcusaureus；bisectionmethod现代药理研究证明,大黄具有抗菌、抗肿瘤、降低血压、健胃、利胆、保肝、强心、延缓衰老、调节免疫功能等作用。大黄中含有的最主要的5种羟基蒽醌是：大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。本实验主要通过对这5种羟基蒽醌的提取、分离及对金黄色葡萄球菌的抑菌效果进行比较,.freelL的20%硫酸,再加入125mL的氯仿,75℃回流4h。2.2游离蒽醌的分离2本实验采
3、用pH梯度萃取法进行分离。氯仿总提取液50mL,加pH8的缓冲液17mL,振摇,静置,缓冲液层加盐酸酸化至pH3,静置,沉淀,抽滤得大黄酸,用冰醋酸重结晶得大黄酸精品。剩余氯仿层加pH9.9的缓冲液30.5mL,振摇,静置,缓冲液层加盐酸酸化至pH3,静置,沉淀,抽滤得大黄素,用冰醋酸重结晶得大黄素精品。剩余氯仿层加pH13的缓冲液60mL,振摇,静置,缓冲液层加盐酸酸化至pH3,静置,沉淀,抽滤得芦荟大黄素,用冰醋酸重结晶得芦荟大黄素精品。剩余氯仿层回收氯仿,得大黄酚与大黄素甲醚混合物。2.3提取物溶液的配制将各提取物用其相应的缓冲液配制成浓
4、度6mg/mL的溶液。2.4大黄中5种游离蒽醌抑菌作用的检验2.4.1培养基的制备牛肉浸膏0.15%,酵母浸膏0.6%,蛋白胨0.6%,葡萄糖0.1%,琼脂1.8%,pH6.9～7.1,常水配制。2.4.2操作过程制备50mL培养基,灭菌30min。在超净工作台上,先倒出30mL至培养皿中,再于50℃左右向另外20mL培养基中迅速加入0.6mL菌悬液,混匀,倒入同一个培养皿中。待培养基凝固后,分别点上5μL、浓度为6mg/mL的各提取物溶液。在37℃恒温培养箱中培养10h,然后进行美蓝染色。量取100mL95%乙醇,加浓盐酸1滴,即为酸性乙醇。
5、量取100mL95%乙醇,加氢氧化钠2g,振摇,待溶解后即为碱性乙醇。取美蓝溶液20mL倒入平板中,用三角耙涂匀,2min后倾去,倒入酸性乙醇20mL,2min后倾去,倒入碱性乙醇20mL,2min后倾去。细流自来水冲洗3min,倾去并吸干浮水,快速贴上滤纸1张,用三角耙赶走气泡,10min后揭下滤纸,晾干。5种游离蒽醌抑菌圈直径：大黄酸为5mm,大黄素为9mm,芦荟大黄素为3mm,大黄酚与大黄素甲醚混合物为0mm。2.4.3二分法测定各提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度3准备16支试管,其中1支作为空白对照组,其余15支平均分成3组,分别代
6、表3种不同的成分,每组分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号,并用记号笔标明。然后用相应的缓冲液配制成不同浓度的提取物溶液,向试管中加入培养基(配方与2.4.1相同,但不加琼脂),将培养基与提取物溶液充分混合后,灭菌。最后在超净工作台上分别向3组试管中(除空白对照组)分别加入金黄色葡萄球菌菌悬液。具体加入量见表1～表3。培养24h酸的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号试管全部长菌,只有Ⅰ号试管没有长菌；芦荟大黄素的情况与大黄酸一样,只有Ⅰ号试管没有长菌。大黄素的抑菌作用最好,Ⅰ、Ⅱ管都没有长菌,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ号试管全部长菌表1大黄酸不同浓度溶液的抑菌作用（略）表2大黄素不同浓度溶
7、液的抑菌作用（略）表3芦荟大黄素不同浓度溶液的抑菌作用（略）3讨论二分法具有简便、准确、省时等特点。将待测成分按其前一个的一半浓度稀释,首先在数值计算上很方便,不用大量的计算；其次在配溶液时不容易弄乱出错,只进行稀释半倍即可；第三是在做出结果后,直接用肉眼就可以观察结果,方便快捷,无须动用其他仪器,节省时间。实验结果表明,大黄中大黄素、芦荟大黄素、大黄酸有抑菌作用,大黄酚与大黄素甲醚无抑菌作用。抑菌效果大黄素最好,芦荟大黄素次之,大黄酸最差。【
