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1、ELISA法测定粪样中性激素含量的应用前景论文.freelichthysmolitrix)、牛(BostaurusdomesticusGmelin)等物种粪样的激素检测。随着酶免测定灵敏度的进一步提高,它在医学和生物学领域激素检测方面的应用将会越来越广泛。2酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)分类ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体11。在这种测定方法中有3个必要的试剂:固相的抗菌素原或抗体,即免疫吸附剂(immunosorbent);酶标记的抗原或抗体,称为结合物(conjugate);酶反应的底物12。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出
2、各种不同类型的检测方法。目前已经广泛应用的ELISA方法包括双抗体夹心法、间接法、竞争法以及ABS-ELISA法,其中竞争法适合测小分子抗原,因此针对不能采用双抗体夹心法测定的小分子抗原,如人绒毛膜促性腺激素、甲状腺激素,可以用竞争法测定;双抗体夹心法和ABS-ELISA法由于灵敏度高,能够满足粪样激素测定的灵敏度要求,因此在粪样的激素测定中有广泛的应用前景。2.1双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,用双异性抗体进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗原13。双抗技术曾被应用于测定血液、母乳中的激素。在非损伤性检测方面,曾宪垠等人运用双抗夹心法测定雌性大
3、熊猫被毛中孕酮的含量,最小可测量到0.15pg/孔。由于该检测技术的灵敏度相对较高,而且改良的夹心法灵敏度能够进一步提高,因此能满足粪便激素测定的灵敏度要求。2.2竞争法小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的2个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法进行测量。在激素测定中,属于竞争法的有固相法(solidphasemethod)、双抗体(doubleantibodymethod)和均相酶免疫法(homogeneousEIA),一般用于甲状腺激素、肾上腺皮质激素、雌性激素等的测定。竞争法的灵敏度一般能达到10ng/mL,甚至2.2ng/mL,主要取
4、决于所选的试剂盒种类。2.3BAS-ELISA法BAS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的缩略语,具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点,操作方便,反应结果可用肉眼观察,试验成本低。BAS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(BAB)法2种类型。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素进行显色。与BAB法相比,LAB法操作较简单,但灵敏度较低。何晓顺等14采用LAB法检测切除的病理标本中胆管上皮细胞角蛋白CK9和CK17、癌胚抗原、肝细胞蛋白,以判断肿瘤组织学来
5、源。赵金富等(2004)通过简单的全合成获得了共价结合的雌三醇-生物素复合物(E3-Biotin),结合过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作为免疫分析探针,建立了灵敏的酶联吸附免疫分析新方法以测定血清中的雌三醇,标准曲线线性范围为0.1～10.0ng/mL,检出限为0.06ng/mL。SmithKA利用间接BAB法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg),其灵敏度比常规ELISA高1000多倍。3影响酶联免疫测定的因素及解决办法目前ELISA方法已经被广泛用于粪便中的激素测量,或通过测量粪便中的某项指标作为各种疾病的临床诊断方法15-16。然而,由于一些干扰
6、因素的影响,测量结果有时会出现偏差,造成假阳性或是假阴性。3.1HD-HOOK效应发生在固相法试验过程中,可造成“假低值”甚至“假阴性”错误结果的特殊效应。主要是由于在“一步法”中待测抗原总量过高,使得测定值随着抗原总量增加反而迅速下降。运用稀释测定法可以降低待测抗原总量,避免HD-HOOK效应,设计预试验,确定测量结果最佳的粪样用量也可以达到相同的目的。除此之外,初筛试验方法也能解决这一问题。3.2边缘效应由于抗原-抗体结合反应和酶促反应的速率,都具有温度依赖性,理应在恒温条件下完成全部试验过程。事实上,一般操作在室温,温育在37℃水浴。这种轮换操作过程,由于9
7、6孔板周边孔与内部孔升降温速率的差别,造成周边孔与内部孔结果的差异,可看作是一种“位置效应”。若室温和37℃悬殊过大时,可在板上加盖或贴密封膜,有一定效果。必要时,放弃周边孔不用,这样将造成37.5%(36/96)的资源浪费。3.3弥散限制在固相法中抗原抗体结合、底物与酶的接触、转换的信号产物向液体内弥散等过程中,液、固相中的分子必须穿过液面的Nernst层,也称液固屏障,使反应速率受到限制。采用振荡、离心、微波或超声等方法,可使Nernst层变薄,从而加速反应速率。3.4激素提取液中存在干扰物质通过稀释试验、平行试验或回收率试验可以判断提取液中是否存在干扰物质。
8、在确认提取
