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1、中药复方921粗提物抗肿瘤作用机理研究论文.freelechanismstudy921方1由龙葵、猪苓、莪术、女贞子、王不留行、补骨脂组成。在前期的实验中发现,其具有一定的体内和体外抗肿瘤药效2,且毒性较小。为进一步了解其抗肿瘤作用机理,对其进行实验研究。1实验材料1.1药物中药复方921,将莪术提取挥发油,.freelide)、小牛血清白蛋白(BSA)、Ta公司产品。NP-40、考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品。考马斯亮蓝R-250,英国进口分装、中国医药公司北京采购供应站供应。TritonX-100由香港FARCO公司提供。
2、苯甲基磺酰氟(PhenylmethylSulfonylFluoride,PMSF)为宝灵曼公司进口产品。琼脂糖(Agarose)为Promega公司产品。三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Gibco公司进口。1.3仪器BeckmanLS-9800型液闪计数仪。COULTEREPICS-XL型流式细胞光度仪、碘化丙啶(propidiumiodide；PI)均为美国Sigma公司产品。2实验方法2.1DNA、RNA和蛋白质等大分子生物合成检测取对数生长期的人前列腺癌细胞PC-3M,消化计数制成2×105/mL的细胞悬液,按每孔100μL接种于
3、96孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。随后,加入100μL含不同浓度药液和溶剂对照的培养基,同时设空白对照组(不加细胞),每组平行3孔,置于培养箱继续培养12、24h。在终止作用前4h,每孔加入3H-TdR、3H-UR和3H-Leu,终浓度为1μCi/孔。4h后吸出含同位素标记的溶液,每孔加入0.25%胰酶60μL,于37℃消化30min。用自动细胞收集器将每孔细胞分别收集于玻璃纤维膜上,蒸馏水冲洗20次,取出膜,置于红外烤箱中80℃干烤15min,剪下膜片,分别置于经相应标记的液闪瓶中(内装4mL闪烁剂、0.4%PPO
4、和0.01%POPOP的二甲苯溶液),暗处放置15min后,用液闪计数仪测定每个样品的cpm值。2.2细胞周期检测方法取处于对数生长期的PC-3M肿瘤细胞,制成浓度为3×105/100mL培养瓶的细胞悬液。24h后分成4组,分别为对照组和高、中、低(贮存母液稀释度：1∶5、1∶10、1∶20)不同药物剂量组。分别于加药后24、48、72、96h,收集贴壁和悬浮细胞,离心后用4℃预冷1×PBS洗涤,再离心,经预冷1×PBS溶解后加入70%乙醇5mL固定过夜。离心去乙醇,用预冷1×PBS溶解,再次离心并溶解于0.5mLPropidiumi
5、odide染液(PI2μg/mL,RNase1mg/mL,Glucose1mg/mL,PBS1mL)中。置于4℃暗处染色反应1h。随后经300目筛过滤后上样,进行流式细胞仪检测。2.3的DNA合成有抑制作用，并呈现出作用时间和作用剂量依赖性(见表1),而对细胞的RNA和蛋白的合成则无显著影响。921方对前列腺癌细胞的生长抑制作用可能与抑制细胞内DNA等大分子的有效生物合成途径有关。表1921方对前列腺癌细胞PC-3M的DNA合成抑制率(略)3.2对前列腺癌细胞株PC-3M细胞周期的影响921方体外加药,在不同稀释度、不同作用时间时均体
6、现出S期阻滞作用,并具有剂量依赖性的增加细胞S期比例,尤其经921方1∶5稀释度作用72h后,甚至使得G2/M期细胞缺失,使得细胞完全阻滞在S期。这与前述的DNA合成抑制有一定联系。以此推测,药物可能通过影响S期中的某些重要功能分子而起到S期阻滞作用。结果见表2。表2921方对体外PC-3M细胞周期分布的影响（略）3.3921方对S期相关蛋白CyclinA、CyclinB、p21、p27表达的影响的S期阻滞作用,可能通过诱导S期相关蛋白CyclinA的表达下调而起作用。3讨论921方抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞DNA合成、诱导C
7、yclinA蛋白表达下调并进而导致细胞周期S期阻滞有关。细胞周期分为G1、S、G2、M共4个期,S期的主要特征是DNA的合成与复制,与S期相关的重要分子有许多,如DNA聚合酶、组蛋白、CyclinA、CyclinB、cdk1、cdk2、E2F、pRB、p27、p21、p107等,其中细胞周期蛋白和其激酶、抑酶常形成为一功能复合物,并发挥重要作用。CyclinA蛋白是一种细胞周期蛋白,在细胞进入S期后表达显著增高,并与cdk2和p27结合成复合物3,在S期中发挥重要作用。而在S-G2期转换中,CyclinA则转而与cdk1结合,并继续发
8、挥作用。大部分影响细胞周期的药物都是通过影响细胞的CDKs或CIKs等蛋白激酶而起作用,而921方是通过何种途径诱导CyclinA表达下调,尚有待深入。【
