尿激酶对大鼠胸膜成纤维细胞增殖与细胞凋亡的影响

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1、尿激酶对大鼠胸膜成纤维细胞增殖与细胞凋亡的影响邵景韫，刘安，戚好文，董玉【关键词】尿激酶；胸膜;成纤维细胞；细胞凋亡　Effectofurokinaseoncellproliferationandapoptosisofratpleuralfibroblasts【Abstract】AIM：Tostudytheeffectofurokinaseonthecellproliferationandapoptosisofratpleuralfibroblasts.METHODS:Ratpleuralfibrob

2、lastsarilyculturedto4-12passages，andthenthemediumicroscopeorphologicalchange.Apoptosisbodiesinedbyfluorescentstaining.Floetryberofviablecellsintimeandconcentrationdependentmanners.Noapoptosisbodyorapoptoticcellsetry.CONCLUSION:Antiproliferativeeffectofu

3、rokinaseonratpleuralfibroblastsisconfirmed，butnotrelatedtocellapoptosis.【KeyAb,小鼠抗大鼠角形蛋白mAb,小鼠抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原mAb,小鼠抗大鼠CD45抗原mAb(武汉博士德生物工程有限公司)；CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；酶连免疫检测仪(国营华东电子管厂)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司).1.2方法1.2.1胸膜FB的

4、分离、培养、纯化与鉴定用脊椎脱臼法处死SD雄性大鼠，无菌剥离胸膜，剪成1mm×1mm×1mm左右的碎块，均匀铺满培养瓶底，加入含100mL/LFBS的RPMI1640培养液，于37℃,50mL/LCO2条件下培养，2.5g/L胰蛋白酶消化，按1∶2传代培养，自然纯化.倒置显微镜下观察细胞学形态，对第4代细胞进行细胞鉴定，以卵蛋白生物素过氧化物酶复合法(ABC)法分别用抗细胞波形蛋白、抗细胞角形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的小鼠抗大鼠mAb作免疫细胞化学染色鉴定胸膜FB.1.2.2MTT法观

5、察UK对大鼠胸膜FB增生的作用以2.5g/L胰蛋白酶消化第4～6代大鼠胸膜FB,将单细胞悬液以5×107/L密度接种于96孔培养板,每孔200μL，37℃，50mL/LCO2条件下培养，2～3d后细胞长满96孔培养板的1/2，再用无血清的RPMI1640培养24h，使细胞同步于G0期.然后更换培养液，加入含有不同浓度UK的培养基（0，5×106，10×106，20×106，30×106U/L），设12个复孔，分别培养24，48，72，96h.实验结束前4h，每孔加入MTT溶液20μL，继续培养4h后，

6、吸弃上清，每孔加入150μLDMSO，振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔A490nm值.以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线.1.2.3观察UK对大鼠胸膜FB凋亡的作用1.2.3.1光镜形态学观察在6孔培养板中加入盖玻片，细胞长满后加入不同浓度的UK（5×106，10×106，20×106，30×106U/L），不加药孔为对照组，24h后收集盖玻片，PBS冲洗，纯丙酮固定8min，用1g/L的苏木精,0.1g/L的伊红常规染色、脱水、透明、封片.光镜下观察形态学改变.1

7、.2.3.2细胞荧光染色分别收集经不同浓度UK处理24h的细胞，加入100mg/L丫啶橙荧光染色液染色10min，CaCl2分化，荧光显微镜下进行细胞凋亡的形态学观察.1.2.3.3流式细胞仪结合PI及AnnexinVFITC双标记染色测定细胞凋亡选对数生长晚期的细胞，分别加入5×103，10×103，20×103，30×103U/mLUK，24h后将5×105个细胞转移至离心管，用50μL结合缓冲液重悬细胞，每组分别加入PI及AnnexinVFITC，室温避光30min上样，立即用流式细胞仪分析凋亡

8、率.统计学处理：数据以x±s表示，经SPSS软件分析，组间比较采用One值均低于对照组.其中，5×106，10×106，20×106，30×106U/LUK较对照组降低显著（P0.05），显示UK以时间和剂量依赖方式抑制细胞增殖（图3）.2.3UK对大鼠胸膜FB凋亡作用的影响光镜形态学观察对照组大鼠胸膜FB大多数呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列.UK作用24h后，未发现凋亡细胞（图4）.荧光显微镜形态学观察对照组大鼠胸膜FB大多数呈