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1、miR210在皮肤慢性溃疡愈合中的作用湘潭市中心医院湖南湘潭411100【摘要】目的：探究miR210在皮肤慢性溃疡愈合中的作用。方法：选取我科皮肤慢性溃疡患者，取其溃疡组织进行细胞培养作为实验组，对照组为正常皮肤组织细胞,qRT-PCR法检测两组表皮细胞内miR210相对表达量的变化；利用RNA干扰技术沉默miR210基因，转染溃疡细胞，CCK-8试剂盒检测转染后细胞活性变化；结果:qRT-PCR法检测实验组细胞12h、24h、48hmiRNA-210相对表达量分别为1.2、1.7、2.9,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)；miRNA-2
2、10基因沉默后转染细胞4h后，实验组细胞活力为0.75,转染6h后活力下降为0.63,与对照组相比差异具有显著性(P<0.05)。结论：皮肤溃疡与miR210相对表达相关，且miR210沉默后能够抑制受损细胞的活性，促进溃疡修复。【关键词】miR210;皮肤慢性溃疡；溃疡愈合；RNA干扰随着人口老龄化趋势的增长，慢性皮肤溃疡发病率逐渐升高，临床上治疗周期长，难以根治，且复发率高，严重影响患者的身心健康，因此如何有效治疗慢性皮肤溃疡是当前的重要任务［1］。miRNA是一类皮肤调控因子通过与mRNA相结合调控相应基因的表达，在维持皮肤更新、功能平衡和皮肤
3、损伤修复方面发挥着重要的调控作用［2］。miR210是一类缺氧相关miRNA,参与DNA损伤修复及细胞的增殖凋亡生理过程［3］。为研究miR210在皮肤慢性溃疡愈合中的作用，选取我科皮肤慢性溃疡患者溃疡组织20份作为研究对象，通过RNA干扰技术沉默miR210基因后检测miR210在皮肤慢性溃疡愈合的分子机制，为治愈皮肤慢性溃疡提供一定的理论基础。1.实验材料1.1研究对象选取我院皮肤科皮肤慢性溃疡患者20人作为研究对象1.2仪器与试剂含10%小牛血清、双抗RPMI164培养基、胰蛋白酶购自于美国Hyclone公司；Opti-MEM、DMEM培养基购
4、自于上海拓然生物科技存限公司；Lipofectamine2000细胞转漿试剂购自于美网Invitrogen公司；2×SYBRGreenMix订购于Takara公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自于美国同仁公司；CO2细胞培养箱、订购于美国Thermo公司，CFX96Real-TimePCR仪购自于美国Bio-Rad公司。1.方法2.1细胞培养采集患者表皮溃疡组织放入PBS溶液中，清洗3次，加入10%小牛血清的RPMI164培养基5mL,置于5%CO2培养箱内培养，当细胞贴壁生长数0达到80%,加入胰蛋白酶消化30min，小心吸取细胞液，
5、加入新鲜DMEM培养基，800rpm离心5min,收集细胞，按照1:3的比例进行传代培养，第3代细胞可用于后续试验。1.2qRT-PCR法检测细胞内miRNA-210表达将收集后的细胞参照RNA提取和反转录试剂盒进行细胞RNA提取和反转录，miRNA-210荧光定量引物序列为：F:S'-CGCAAGGATGACACGCAAAUR:S^-TTACCTAGCGTATCGTTGAd,以GADPH为内参苏序列为：F:5I-GGATGATGTTCTGGAAGAGCC-31R:5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGC-3',反应体系:lOuL2&time
6、s;SYBRGreenMix,上下游引物各luL,ddH208uL,10×cDNA模板luL。按照反应程序95°C3min,94°C10s、60°C20s,72°C2min,30cycles,72°Cl0min。利用CFXmanager3.0软件进行Cq值分析，以GADPH作为内参基因按照2-ΔΔCq算法进行基因相对定量表达分析。1.3miRNA-210基因过表达后对细胞的抑制根据miRNA-210基因序列设计其siRNA引物：F:S^AATCTGTGCGTGTGACAG-S*,R：5'-TTACCTAGCGTAT
7、CGTTGAC-3',将2.5uLsiRNA、luLLipofectamine2000分别加入Opti-MEN培养基55ul中，静置5min，混匀加入溃疡组织细胞培养液中，反应20min后，分别转染4h、8h后，弃去转染试剂，加入完全培养基培养细胞。采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，以未转染的正常细胞为对照，计算细胞相对增殖活力。2.4统计学分析采用SPSS18.0软件对实验所得数据进行处理分析，计数资料采用率表示，采用检验，以P<0.05为差异有统计学意义。1.结果3.1qRT-PCR法检测细胞内miRNA-210相对基因表达细胞培养后12h、24
8、h后实验组细胞内miRNA-210相对表达量1.2、1.7，与对照组相比表达量有所升高，但差异不具有显著性(
